Etken: Ornithobacterium rhinotracheale B 3263/91 (serotip A) suşu, Dr. Hafez Mohamed Hafez, Institute of Poultry Diseases, Free University Berlin, Almanya’dan temin edildi. ORT B 3263/ 9 (serotip A) suşundan inokulum hazırlandı. Bakterinin %7 kanlı agara ekimi yapıldı, %5-10 CO2’li ortamda 48 saat inkube edildi. Bakteriyel süspansiyon 3.8x108 koloni oluşturan hücre sayısı (Colony Forming Units: CFU/mL) olarak civcivleri infekte etmek için kullanıldı. Kültür izolasyonu için, akciğer ve trachea örnekleri aseptik olarak %7 koyun kanı içeren beyin kalp infüzyon agarı (BHIA) ve MacConkey agara ekim yapıldı. 48 saat %5-10 CO
2 lik atmosferde mikroaerofilik ortamda üremeye bırakıldılar. Bakterinin identifikasyonu koloni morfolojisi, gram boyama ve biyokimyasal testlere göre yapıldı.
ORT Suşunun Antibiyotik Duyarlılık Testi: Oksitetrasiklin, Enrofloksasin, Amoksisilin-Klavulanik asit, Gentamisin, Eritromisin, Trimetoprim-Sülfametoksazol, Ampisilin, Streptomisin, Penisilin ve Sefaleksin etken maddelerini içeren antibiyotik diskleri firmalardan temin edilerek antibiyogram testinde kullanıldı. Ornithobacterium rhinotracheale suşunun antibotiklere duyarlılığı Kirby Bauer disk diffuzyon yöntemine 18 göre yapıldı. Mueller Hinton Agar (Merck) besi yeri üzerine antibiyotik diskleri (Oksitetrasiklin, Enrofloksasin, Amoksisilin-Klavulanik asit, Gentamisin, Eritromisin, Trimetoprim-Sülfametoksazol, Ampisilin, Streptomisin, Penisilin ve Sefaleksin) yerleştirildi ve 37 ⁰C’de 24 saat inkube edildi. Bir gecelik inkubasyondan sonra petrilerdeki inhibisyon zon çapları cetvel ile ölçüldü. The National Committe for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS)’in önerdiği duyarlı ve dirençli sınırlarına göre değerlendirme yapıldı. Yapılan antibiyogram testi sonucu en duyarlı antibiyotiğin Enrofloksasin olduğu belirlendi.
Deney Aşaması: Çalışmamızda yerel etik kurulu onayı (Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Elazığ Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu, No: 23.10.2008-6) alındıktan sonra kuluçkadan çıkan 96 adet civciv önceden dezenfekte edilmiş binaya alınarak 4 haftalık olana kadar büyütüldü. Daha sonra 48 adet civciv bir başka binaya alınarak, 4 ayrı bölmeye ayrıldı, bu civcivlere ORT 3263/91 suşu (serotip A) verildi. Diğer 48 civciv ise kontrol olarak ilk alındıkları binada kaldılar, bu civcivler de 4 ayrı bölmeye ayrıldı (Her bölme 2 m2). Gruplara enrofloksasin 19 ve KAFE uygulaması 20,21, civcivler 4 haftalık olduktan sonraki 17. günde aynı zamanda başlatıldı. Büyütme ünitesinde 23 saat aydınlık, 1 saat karanlık aydınlatma programı uygulanırken, nem oranı %50-70’e ayarlandı. Sıcaklık ise 27 ⁰C’den başlatılıp her hafta 2 derece azaltılıp, 4. haftadan sonra 18-21 ⁰C arasında sabitlendi. Çalışmada NRC 22 standartlarına göre mısır ve soya küspesine dayalı 0-21. günler arası etlik civciv yemi (%23 HP, 3.200 kcal/kg ME), 22-42. günler arası etlik piliç yemi (%20 HP, 3.200 kcal/kg ME) ve 43-56. günler arası son dönem etlik piliç yemi (%18 HP, 3.200 kcal/kg ME) rasyonları olmak üzere 3 karma yem izokalorik ve izonitrojenik olarak özel bir yem fabrikasına hazırlattırıldı. Gruplar;
I. Kontrol Grubu: Normal civciv büyütme yemi ile deney süresince bakım ve beslenmesi yapıldı.
II. Antibiyotik Grubu: Enrofloksasin (10 mg/kg/gün), 6 gün süre ile tek başına içme sularına katıldı.
III. KAFE Grubu: 6 gün boyunca KAFE (10 μmol/kg) i.p olarak uygulandı.
IV. Antibiyotik+KAFE Grubu: Enrofloksasin (10 mg/kg/gün) içme suyuna katılarak, KAFE (10 μmol/kg) i.p olarak 6 gün süre ile uygulandı.
V. ORT Grubu: ORT 3263/91 suşu (serotip A) mililitre başına 3.8x108 CFU/mL içeren inokulum aerosol olarak verildi.
VI. ORT+Antibiyotik Grubu: ORT 3263/91 suşu (serotip A) mililitre başına 3.8x108 CFU/mL içeren inokulum aerosol olarak verildi. 17. günde enrofloksasin uygulanmasına başlandı ve 6 gün süre ile tek başına enrofloksasin (10 mg/kg/gün) içme sularına katıldı.
VII. ORT+KAFE Grubu: ORT 3263/91 suşu (serotip A) mililitre başına 3.8x108 CFU/mL içeren inokulum aerosol olarak verildi. 17. günde KAFE (10 μmol/kg i.p olarak) uygulanmasına başlandı ve uygulama 6 gün sürdü.
VIII. ORT+Ant+KAFE Grubu: ORT 3263/91 suşu (serotip A) mililitre başına 3.8x108 CFU/mL içeren inokulum aerosol olarak verildi, 17. günde enrofloksasin (10 mg/kg/gün) içme sularına katılarak, KAFE (10 μmol/kg) i.p olarak 6 gün süre ile uygulandı.
Enrofloksasin ve KAFE uygulaması sonunda, 7. günde piliçler kesilerek akciğer ve treka dokuları alındı ve analiz yapılıncaya kadar –80 ⁰C’de muhafaza edildiler.
Analizler: Doku örnekleri iki süzgeç kağıdı arasında suyu alındıktan sonra tartılarak %1.15’lik KCl içinde 1:10 oranında (ağırlık/hacim) sulandırıldı ve kırılmış buz içerisinde Potter-Elvehjem cam-cam homojenizatörle homojenize edildi. Homojenatlar soğutmalı santrifüjde +4 ⁰C’de 3.500 rpm’de 15 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatantlarda MDA, SOD, GSH, KAT, GSH-Px, nitrik oksit (NO) ve protein tayinleri yapıldı.
Lipid peroksidasyon sonucu oluşan MDA tayini Placer ve ark. 23 yöntemine göre ölçüldü. Bu yöntem lipid peroksidasyonunun aldehit ürünlerinden biri olan MDA’nın TBA ile reaksiyonu temeline dayanır. Oluşan MDA, TBA ile pembe renkli bir kompleks oluşturmakta ve bu çözeltinin absorbansı 532 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülerek lipid peroksidasyonun derecesi saptanmaktadır.
SOD aktivite ölçümü ksantin-ksantin oksidaz sistemi ile üretilen süperoksit radikalinin nitroblue tetrazoliumu (NBT) indirgeyerek renk oluşması esasına dayanır. Bu şekilde üretilen süperoksit radikalinin NBT’u indirgemesi 560 nm’de maksimum absorbans veren mavi renkli formazon oluşumu ile sonlanır 24.
GSH-Px aktivite düzeyi Lawrence ve Burk 25 yöntemine göre ölçüldü. GSH-Px, okside glutatyon (GSSG)’a okside ederken kümenhidroperoksit kullanır. Renk ajanı olarak 5.5-ditiyo-bis [2-nitrobenzoik asit] (DTNB) solusyonu ile karıştırılması sonucu hem kör ve hem de örneklerde meydana gelen sarı renk kompleksinin 412 nm’de spektrofotometre ile okunması belirlenir.
KAT aktivitesi Aebi 26 yöntemine göre yapıldı. KAT enzimi H2O2’i yıkarak H2O ve O2’e dönüşümünü katalize eder. H2O2’in katalaz tarafından yıkım hızı, H2O2’in 240 nm dalga boyunda ışığı absorbe etmesinden yararlanılarak ölçüldü.
GSH düzeyi Sedlak ve Lindsay 27 tarif ettiği şekilde belirlendi. Bu metot renk ajanı olarak DTNB eklendiğinde sülfidril gruplarının oldukça stabil sarı renk oluşturması temeline dayanmaktadır.
Nitrit ölçümü Griess reaksiyonuna dayanan spektrofotometrik bir ölçümdür 28. Griess reaktifinde bulunan H3PO4 ile nitrit reaksiyona girer ve nitröz asit meydana gelir. Nitröz asit sulfanilamid ile reaksiyona girerek diazobenzosülfonik asiti meydana getirir. Bu da ortamda bulunan naftiletilendiaminle koyu pembe renkli bir bileşik verir, bu bileşiğin rengi spektrofotometrede 545 nm’de okunur.
Homojenatlardaki protein miktarı standart olarak sığır serum albümini kullanılarak Lowry ve ark. 29 yöntemine göre ölçüldü.
Analizlerdeki kimyasallar Sigma-Aldrich, Merck, Fluka gibi firmalara ait olup KAFE Sigma-Aldrich firmasından, Enrofloksasin (Baytril) Bayer firmasından temin edilmiştir.
İstatistiksel Değerlendirme: Bu çalışmanın istatistiksel analizlerinde SPSS 12.0 paket programı kullanıldı. Gruplar arası farklılığın önemi tek yönlü ANOVA ile grup içindeki farklılıkların derecesi Duncan testi, iki grup arasındaki farklılığın derecesi bağımsız t-testi ile analiz edildi. Veriler; ortalama ± standart hata olarak gösterildi ve anlamlılıkları P<0.05 esas alınarak değerlendirildi.