Geçmişten günümüze KG’nin patogenezisinde rol oynayan birçok faktörün ve farklı sağaltım seçeneklerinin araştırılması amacıyla lakrimal sekrasyonun mekaniksel
22,23, hormonal
24, sinirsel
25,26 ve evaporatif
18,27,28 olarak inhibe edildiği çok sayıda hayvan modeli araştırmaları yapılmıştır. Xiong ve ark.
29 ile Lin ve ark.
30; bu modellerin KG ile ilgili aydınlatıcı veriler sağlamasına rağmen, her birinin kendine özgü özelliklerinin ve sınırlamalarının olduğunu, dolayısıyla KG’nin etiyopatogenezisindeki karmaşıklığı ve hastalığın kronik formunu tam olarak yansıtamadıklarını ileri sürmüşlerdir. Bu görüşten yola çıkan aynı araştırmacılar, oftalmik preparatların bileşimine katılan BEK gibi kuvarterner amonyum prezervatiflerinin uzun süreli kullanıldıklarında PGF’nin lipid fazını değiştirerek epitelyal hücre hasarına neden olduğunu ve bu sayede PGF stabilitesinin hızlı ve progresif bir şekilde bozulduğunu belirterek, KG modellerinde BEK’i kullanmışlardır. Tavşanlarda %0.1’lik BEK’i 14 gün süreyle günde 2 kez topikal olarak uygulayan Xiong ve ark.
29, bu süre sonunda deneklerde klinik olarak KG’ye benzer belirtiler oluştuğunu saptamışlardır. Lin ve ark.
30, BEK’in bu defa %0.2’lik solüsyonunu farelerde 7 gün süreyle günde 2 kez topikal olarak uygulamışlar ve Xiong ve ark.
29’nın elde ettiği klinik belirtilere ek olarak deneklerin gözyaşı kırılma zamanlarının kısaldığını, oküler dokularda yangısal hücre infiltrasyonunun arttığını ve konjunktival fornikslerinde goblet hücre sayısının azaldığını saptamışlardır. BEK’in oküler yüzeyde oluşturduğu bu olumsuz etkilerden yola çıkan birçok araştırmacı, son yıllarda farklı hayvan türlerini kullandıkları KG modeli çalışmalarında BEK’e yönelmişlerdir
31-33. Mevcut çalışmada KG modeli oluşturmak amacıyla deneklere topikal olarak 14 gün süreyle %0.2’lik BEK’den 5 μL uygulanmıştır. Bu süre sonunda yapılan klinik parametrik ölçümlerde (15. gün), BEK uygulanmayan kontrol grubu hariç diğer tüm grup deneklerin başlangıç ölçümlerine göre göz kırpma ile konjunktival goblet hücre sayısı ortalamalarının belirgin bir şekilde azaldığı belirlenmiş ve bu ortalamaların KG grubunda çalışma sonuna kadar belli bir seviyede devam ettiği gözlenmiştir. Histopatolojik verilere bakıldığında, diğer tüm gruplardan farklı olarak KG grubunun korneal epitelyal tabakasının inceldiği, korneal damarlaşma ile yangısal hücre sayısının anlamlı şekilde yüksek olduğu görülmektedir. Tüm bu parametreler birlikte değerlendirildiğinde, BEK’in deneklerde birçok araştırmacının da belirttiği gibi
29-32 hem klinik hem de hücresel düzeyde KG’ye benzer bir etki oluşturduğu sonucu çıkmaktadır.
Prekorneal gözyaşı filminin oküler yüzeye düzgün bir şekilde yayılmasında, lipid tabakanın yeterli düzeyde salgılanmasında ve yabancı cisimlerin temizlenmesinde güçlü ve hızlı göz kırpma refleksinin önemine dikkat çekilmiştir 34,35. PGF’nin lipid katmanındaki incelmelerin gözyaşının aşırı buharlaşmasına neden olarak osmolaritesini arttırdığı ve gözyaşı kırılma zamanını kısalttığı belirtilmektedir. Oküler yüzeydeki bu değişikliklerin KG’nin patogenezisinde anahtar rol oynadığı bilinmektedir 36. Mevcut çalışmada, BEK uygulamasını takip eden ilk ölçüm zamanı olan 15. günde kontrol grubu hariç diğer tüm grupların göz kırpma sayısı ortalamalarının başlangıç ölçümüne göre belirgin bir şekilde azaldığı saptanmıştır. BEK uygulanmayan kontrol grubu deneklerde ise başlangıç ölçümünde 5.44±0.53 /dk. olarak kaydedilen göz kırpma sayısı ortalamasının çalışma boyunca tüm ölçüm zamanlarında anlamlı bir değişiklik göstermediği görülmektedir. Bu veriler, göz kırpma sayısı parametresine göre BEK uygulanan tüm gruplarda KG modelinin amacına ulaştığını göstermektedir. Çalışma sonunda tedavi gruplarının genel bir değerlendirilmesi yapıldığında, en yüksek göz kırpma sayı ortalamasının %50 SAS grubunda ölçüldüğü, belirtilen parametre yönünden bu grup ile sadece %35 SAS grubu arasında istatistiki açıdan önemli bir farklılık olmadığı belirlenmiştir. İkinci en yüksek göz kırpma sayı ortalamasına sahip olan %35 SAS grubunun ise %100 SAS grubu hariç diğer tüm grupların ortalamalarından belirgin şekilde farklı olduğu bulunmuştur. Farelerde Botulinum-B toksini kullanılarak oluşturulan KG modelinde farklı dozlardaki insan amniyon sıvısının terapötik etkileri karşılaştırılmış ve gruplar arasında göz kırpma sayısı parametresine göre önemli bir farklılık saptanmamıştır 9. Aynı modelin kullanıldığı ve farklı antiinflamatuar ajanların etkilerinin araştırıldığı diğer iki çalışmada da kontrol ve deney grupları arasında göz kırpma sayıları yönünden anlamlı değişimler saptanmamıştır 37,38. Bu sonuçlar, BEK ile oluşturduğumuz KG modeli ile Botulinum-B toksini kullanılarak oluşturulan diğer deneysel çalışmalar arasında belirtilen parametre yönünden farklılıklar olduğunu göstermektedir. Xiong ve ark. 29, BEK’in PGF’nin direkt olarak lipid ve müsin tabakalarında bozulmaya yol açtığını ve böylelikle PGF’nin stabilitesinin hızlı ve progresif bir şekilde bozulduğunu belirtirken, ana lakrimal beze enjekte edilen Botulinum-B toksininin ise aköz gözyaşı üretim miktarının azalmasına neden olarak PGF’nin aköz katmanını bozduğu ve bu sayede KG’nin aköz yetersizlik formunu yansıttığı bildirilmiştir 38. Bilindiği üzere, bazı KG olgularında hastalığa işaret eden klinik belirtiler bulunmasına rağmen aköz gözyaşı üretim miktarları normal çıkabilmektedir 39. Dolayısıyla KG oluşturmak amacıyla kullanılan modeller arasındaki farklılıklar, hastalığın farklı formlarını yansıtarak, çalışmanın klinik parametrelerinde farklı sonuçların alınmasına neden olabilir. Mevcut çalışmada BEK uygulanan deney gruplarında göz kırpma sayısı ortalamasının model oluştuktan sonraki ilk ölçüm zamanı olan 15. günde belirgin bir şekilde düşmesi, BEK’in gözyaşının aşırı evaporasyonuna neden olup, PGF stabilitesini bozmasına bağlanabilir. %35, %50 ve %100 SAS grubu deneklerin göz kırpma sayılarında çalışma sonunda gözlenen belirgin artışlar, SAS’ın orta ve yüksek yoğunluklarının PGF’nin lipid katmanı üzerine pozitif etki oluşturabileceğine işaret etmektedir. Nitekim göz kırpma sayısındaki artışların oküler yüzeyde kurumaya bağlı gelişen korneal hasara karşı koruyucu bir etki oluşturduğu ve bu durumun PGF’nin stabilitesinin devamında önemli rol oynadığı belirtilmiştir 40.
Prekorneal gözyaşı filminin en iç katmanı olan müsin tabaka, konjunktival goblet hücreleri tarafından üretilmektedir. İnsan ve hayvanlarda goblet hücre yoğunluğundaki azalmaların müsin tabakanın yapısını ve kalınlığını bozarak, oküler yüzey bütünlüğüne zarar verdiği bilinmektedir 26,41. Goblet hücre yoğunluğundaki değişiklikler, PGF’nin stabilitesini direkt olarak etkilediğinden, gerek klinik gerekse deneysel KG çalışmalarında bu parametrenin ortaya konulması hastalığın ve seyrinin belirlenmesi açısından önemli bulunmaktadır 42. BEK’in, lipid tabakayı bozup, müsin üretiminde azalmalara yola açarak, PGF’nin instabilitesine ve gözyaşının aşırı buharlamasına neden olduğu bildirilmiştir 29,43. Xiong ve ark. 29, tavşanlarda KG oluşturmak amacıyla %0.1’lik BEK’i topikal olarak 14 gün süreyle kullanmışlar ve BEK’in olgularda konjunktival goblet hücre sayısını azalttığını saptamışlardır. Lin ve ark. 30 ise farelerde BEK’in bu kez %0.2’lik dozunu 7 gün süreyle kullanmışlar ve bu süre sonunda deneklerin konjunktival goblet hücre sayısında benzer şekilde belirgin azalmalar saptamışlardır. Aynı bulgular, Yang ve ark. 43’nın BALB/c ve C57BL/6 ırkı farelerde BEK ile oluşturulan karşılaştırmalı KG modeli çalışmasında da alınmıştır. Mevcut çalışmada 14 günlük BEK uygulamasından sonraki ilk ölçüm zamanında kontrol grubu hariç diğer tüm gruplarda impresyon sitolojisi parametresine göre goblet hücre sayısında istatistiki açıdan önemli azalmalar belirlenmiştir. Bu azalmaların KG grubunda çalışma sonuna kadar anlamlı bir değişiklik göstermediği izlenmiştir. BEK uygulaması yapılmayan kontrol grubunda ise başlangıç ile çalışma sonunda kaydedilen ortalamalar arasındaki fark anlamsız bulunmuştur. Bu veriler, %0.2’lik BEK’in 14 gün süreyle günde 2 kez topikal olarak uygulanmasının deneklerde KG’nin klinik belirtilerinden biri olan konjunktival goblet hücre sayısında belirgin azalmalara neden olduğunu göstermektedir. Model oluştuktan sonraki aşamada, goblet hücre sayısının tüm tedavi gruplarında arttığı, çalışma sonundaki en yüksek artışın ise %35 SAS grubunda olduğu, %20, %50 ve %100 SAS gruplarındaki artışların ise istatistiki açıdan anlamlı bir fark göstermediği saptanmıştır. Quinto ve ark. 7, Botulinum-B toksini kullanarak oluşturdukları KG modelinde, insan amniyon sıvısının deneklerin inferior ve superior konjunktivalarındaki goblet hücrelerinin yoğunluğunda artışlara neden olduğunu kaydetmişlerdir. Model çalışmalarında %0.1’lik BEK’i 10 gün süreyle günde 2 kez topikal olarak uygulayan ve konjunktival goblet hücre sayısını çalışma sonunda yapmış oldukları PAS boyama ile belirleyen Xiao ve ark. 31, amniyotik membran ekstraktı ile tedavi edilen gruplarda, BEK uygulaması sonunda azalan goblet hücre sayısında artış olduğunu saptamışlardır. 3 farklı konsantrasyondaki insan amniyon sıvısının terapötik etkilerinin karşılaştırıldığı bir başka KG modelinde de, deneklerin inferior ve superior bulbar konjunktival dokularındaki goblet hücre sayılarının tüm tedavi gruplarında arttığı belirlenmiştir 9. Araştırmacılar, insan amniyon sıvısının goblet hücre sayısında meydana getirdiği bu artışların, goblet hücrelerinin oküler yüzeyi koruyan ve yağlayan müsin tabakanın ana kaynağı olmasından ötürü önemli olduğunu vurgulamışlardır. Çalışmamızda sığır amniyon sıvısının tüm konsantrasyonlarının goblet hücre sayısını arttırması, SAS’ın PGF stabilitesinin ve oküler yüzey sağlığının korunmasına pozitif etki yaptığını göstermektedir.
Lakrimal fonksiyonel üniteyi oluşturan yapılardan biri olan kornea, oküler yüzey sağlığının devamında önemli bir parçadır 1,2. Korneal saydamlık ve optimal görme fonksiyonu için avasküler bir korneanın önemine dikkat çekilmiştir 44. Korneal enfeksiyonlar, kimyasal yaralanmalar, limbal kök hücre eksiklikleri gibi durumlar ile yangısal kökenli hastalıkların korneal damarlaşma sayısını arttırdığı belirtilmektedir 45. Mevcut çalışmada korneal damarlaşma ve yangısal hücre sayısı en düşük kontrol, en yüksek ise KG grubunda ölçülmüştür. Bu sonuçlar, 14 günlük BEK uygulamasının hem yangısal hücre sayısını hem de buna bağlı olarak korneal damarlaşmayı arttığını göstermektedir. Tedavi grupları içinde en düşük korneal damarlaşmanın ve yangısal hücre sayısının %35 ve %50 SAS gruplarında ölçülmesi ise SAS’ın orta yoğunluklarının yangısal süreci ve korneal vaskülariteyi baskıladığına işaret etmektedir. Korneadaki epitelyal hasar, bu katmanın morfolojik açıdan bozulmasına ve incelmesine neden olmaktadır 46. Dolayısıyla korneal kalınlığın korunması, sağlam bir bariyer fonksiyonu ile sağlıklı bir endotele bağlıdır 47. Korneal epitelyal kalınlığın değerlendirilmesi, korneanın durumu ve fizyolojisi hakkında aydınlatıcı bilgiler verdiğinden geçmişten beri birçok KG çalışmasında teşhis metodlarından biri olarak tercih edilmektedir 48-51. Bu çalışmaların bazılarında KG’li hastaların korneal epitelyumlarında belirgin bir değişiklik olmadığı 48,49 bazılarında ise sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında incelme saptandığı rapor edilmiştir 50,51. KG ile korneal epitelyal kalınlık arasındaki ilişki henüz tam olarak aydınlatılamasa da gözyaşı osmolaritesindeki artış ve PGF evaporasyonunun korneal epitelyumda incelmeye yol açabileceği hakim bir görüş olarak karşımıza çıkmaktadır 47. Mevcut çalışmada korneal epitelyal tabakanın en ince olduğu grup KG’dir. Bu sonuç, BEK’in oküler yüzeyin epitelyal hücre membranına zarar verdiği görüşlerini desteklemektedir 29. Nitekim Lin ve ark. 30 de %0.2’lik BEK’in farelerin korneal epitelyumunda incelmelere yol açtığını rapor etmişlerdir. Tedavi grupları içinde korneal epitelyal tabakanın en kalın olduğu grubun %35 SAS olduğu saptanmıştır. Çalışmanın diğer parametrelerine de bakıldığında %35 SAS grubunun en etkili sonuçları veren grupların başında geldiği görülmektedir. Multifaktöriyel bir hastalık olarak tanımlanan KG’nin tedavisinde bir ajana etkili diyebilmek için bu faktörlerin önemli bir kısmını elemine etmesi ve patogenezisteki kısır döngüyü kırması beklenmektedir. Bu açıdan değerlendirildiğinde SAS’ın %35’lik konsantrasyonunun korneal epitelyal kalınlık dâhil birçok yönden güçlü etki gösterdiği görülmektedir.
Çalışma boyunca yapılan klinik parametrik ölçümlere göre 14 günlük BEK uygulamasının tüm gruplarda göz kırpma ve konjunktival goblet hücre sayısını azalttığı, çalışma sonunda yapılan histopatolojik değerlendirmede ise korneal epitelyal tabakayı incelttiği, korneal damarlaşma ve yangısal hücre sayılarını ise belirgin şekilde arttırdığı saptanmıştır. Tedavi grupları içinde en etkili terapötik sonuçlar, göz kırpma sayısına göre %35, %50 ve %100 SAS; konjunktival goblet hücre sayısına göre %35 SAS; korneal damarlaşma, yangısal hücre sayısı ve korneal epitelyal kalınlık parametrelerine göre ise %35 ve %50 SAS gruplarında alınmıştır. Bu verilerden hareketle BEK’in deneklerde KG’deki klinik ve hücresel belirtilere benzer etkiler oluşturduğu, SAS’ın orta ve yüksek yoğunluklarının ise bu belirtiler üzerine pozitif etkiler gösterdiği sonucuna varılmıştır.
Teşekkür
Çalışmanın istatistik aşamasında büyük katkıları olan Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Öğretim üyesi Doç. Dr. Cemal ORHAN’a teşekkür ederiz.
)
)
)
)
)
)
)
