[ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]
Fırat University Medical Journal of Health Sciences
2020, Cilt 34, Sayı 2, Sayfa(lar) 103-109
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
Araşidonik Asit Metaboliti 20-Hete’nin Kardiyak Uyarılma-Kasılma Çiftlenimi Üzerine Akut Etkisi
Uğur DALAMAN1, Yasin GÖKÇE1, Filiz BASRAL2, Nazmi YARAŞ1
1Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı Antalya, TÜRKİYE
2Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı Antalya, TÜRKİYE
Anahtar Kelimeler: 20-HETE, kardiyomiyosit, patch-clamp, uyarılma-kasılma çiftlenimi
Özet
Amaç: Bir araşidonik asit metaboliti olan 20-HETE özellikle kardiyovasküler sistem içerisinde apoptotik süreçlerde ve hücre kaybının gerçekleştiği durumlarda artış gösteren bir moleküldür. Ancak kardiyak doku üzerine etkileri net olarak bilinmemektedir. Bu amaçla kardiyomiyosit fizyolojisi üzerine olan etkisi elektrofizyolojik olarak incelenmiştir.

Gereç ve Yöntem: Çalışmada, sıçan kalbi sol ventrikülünden enzimatik izolasyon yöntemiyle elde edilen tek kardiyomiyositlerden 20-HETE uygulaması öncesi ve sonrası olmak üzere elektrofizyolojik kayıtlar alınmıştır. 20-HETE’nin etkin dozu olan 100nM konsantrasyonu perfüzyon yardımıyla kardiyomiyositler üzerine uygulanarak, akım kenetleme yöntemiyle aksiyon potansiyeli, potansiyel kenetleme yöntemiyle Na+, K+ ve Ca2+ kanal akımları ölçülmüştür. Bununla birlikte sarkomerik kısalma yanıtları 20-HETE inkübasyonu sonrasında elektriksel alan uyarısı ile kaydedilmiştir.

Bulgular: 20-HETE uygulaması sonucunda frekansa bağlı olarak kısalma parametrelerinde gözlenen genlik azalmasının kaybolması yanında yüksek frekanslarda kısalma işlevini gösteremediği bulgusuna ulaşılmıştır. Bununla birlikte, 20-HETE’nin aksiyon potansiyeli genliğini anlamlı oranda azalttığı tespit edilmiştir. Bu azalışa, voltaja bağlı Na+ kanal akımının azalması ve kinetiklerinin yavaşlaması eşlik etmektedir. Buna ilaveten Ito akım yoğunluğundaki azalışında aksiyon potansiyeli genliğinin azalışına katkı sağladığı tespit edilmiştir. 20-HETE inkübasyonu aksiyon potansiyeli süresine ve L-tipi Ca2+ kanal akımları üzerine önemli bir etkisi gözlenememiştir.

Tartışma: Bu çalışmada, 20-HETE’nin kardiyomiyosit uyarılma-kasılma çiftlenimine önemli etkileri olduğu göstermiştir. Özellikle kasılma kinetiklerini, Ca2+ duyarlılığını etkileyerek azalttığı düşünülmektedir. Diğer yandan, voltaja bağlı Na+ kanal akımının ve kinetiklerinin etkilenmesi kalbin uyarılabilirliğine 20-HETE’nin önemli etkileri olduğunu göstermektedir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Giriş
    20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), membran fosfolipid kaynaklı araşidonik asitten kalp ve damar sistemindeki Cytochrome P-450 ω-hydroxylase (CYP4A ve CYP4F izoformları) enziminin metobolik aktivitesi sonucu oluşturulmaktadır. 20-HETE, hem periferik vasküler tonusu hem de böbrek fonksiyonunu düzenleyerek sistemik arter basıncının kontrolünde önemli bir rol oynayan güçlü bir vazokonstriktör olarak bilinmektedir 1,2. Bunlara ek olarak, kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliğinde rol aldığı gösterilmiştir. Sıçan hipertrofik kalp modelinde kardiyak mikrozom 20-HETE seviyesinin yükseldiği ortaya konmuştur 3. Diğer yandan, 20-HETE üretiminin inhibisyonu, iskemi/reperfüzyon hasarının belirgin şekilde azaltılması ve miyokard enfarktüsü boyutunun azaltılması gibi kardiyoprotektif etkilerini gösteren çalışmalar mevcuttur 4-6. 20-HETE, reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini artırması ve mitokondriyal fonksiyonu bozması yoluyla doğrudan kardiyomiyosit apoptozuna neden olduğu da ileri sürülmüştür 7. Ancak, kardiyomiyositlerden 20-HETE salınımını düzenleyen faktörler henüz tam olarak aydınlatılamamıştır.

    Bazı patolojik durumlarda yararlı etkileri ileri sürülmüş olsa da 20-HETE çeşitli kardiyovasküler fonksiyonlar üzerinde olumsuz etkilerinin olduğu bir çok çalışma ile gösterilmiştir 7-9. 20-HETE'nin hipertrofik kardiyak yeniden modelleme ve kardiyak yetmezlikteki olası rolü ile ilgili mevcut bilgi hala yetersizdir. Kalp yetmezliği ile ilişkili kardiyak hipertrofili hastalarda ve hayvan modellerinde CYP4A ve 4F enzimlerinin arttığı rapor edilmiştir. Ek olarak, sıçanlarda izoproteranol ile oluşturulan kardiyak hipertrofide de CYP4A ve 4F artmıştır 3,10. Aynı şekilde, 20-HETE seviyelerinin Angiotensin II kaynaklı hipertrofide de yüksek olduğu gösterilmiştir 11. 20-HETE oluşumunu önlemek için α-hidroksilaz inhibitörü ile ön tedavinin, kardiyak hipertrofinin gelişmesine karşı kısmen koruyucu olduğu ileri sürülmektedir 12.

    Bu bulgular göz önüne alındığında, 20-HETE’nin kardiyovasküler sistem işlevlerinin düzenlenmesinde önemli bir aracı olduğu düşünülebilir. Ancak, son zamanlarda gerçekleştirilen bu çalışmalar yetersiz ve çelişkili bulgular sunmaktadır. Diğer yandan, 20-HETE’nin ventrikül kardiyomiyosit uyarılma kasılma çiftlenimi üzerine etkilerini inceleyen çalışmalar bulunmamaktadır. Dolayısıyla, çalışmamız 20-HETE’nin kalp ventrikül hücreleri üzerine etkilerini ortaya çıkarmak için elektrik alan yardımıyla uyarılan izole sıçan kardiyomiyositlerinde kısalma kinetikleri ile aksiyon potansiyeli ve ilişkili hücre zarı akımlarının voltaj ve akım kenetleme yöntemiyle incelenmesini amaçlamaktadır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    Kardiyomiyositlerin Elde Edilmesi: Çalışmada 3 aylık erkek Wistar sıçanlar kullanılmıştır (Akdeniz Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu; Protokol No: 2013.05.03). Hayvanlar sodyum pento barbital kullanılarak (30 mg/kg vücut ağırlığı) hafif anestezi altına alınıp Langendorff sistemine aortadan bağlanmıştır. Perfüzyon çözeltisinin içeriği (mM olarak): 145 NaCl; 5 KCl; 1.2 MgSO4; 1.4 Na2HPO4; 0.4 NaH2PO4; 5 HEPES; 10 glukoz (pH:7.4) olarak ayarlanmıştır. Kalpler perfüzyon ile yıkandıktan sonra 30–35 dakika süre ile içerisinde kollajenaz bulunan çözelti (Collagenase A type) (0.8–1 mg/ml) ile perfüze edilmiştir. Ardından doku makasla parçalanıp filtreden geçirilerek tek hücreler elde edilmiştir. Ca2+ derişimi final derişimi 1mM olacak şekilde aşamalı olarak arttırılmıştır. Ölçümlerin alınması sırasında 100 nM konsantrasyonunda 20-HETE perfüzyonu gerçekleştirilmiştir.

    Kısalma Parametrelerinin Ölçülmesi: Hücreler elektrot yerleştirilmiş küvet içine alınarak uyarılabilir olanlar 0.5, 1, 2 ve 4 Hz frekanslı 5 V ve 4 ms’lik elektrik alan ile uyarılmıştır. Inverted mikroskoba bağlı hızlı bir kamera yardımıyla (MyoCam, IonOptix Inc., ABD) kayıtlar alınarak dinlenim boyu, kısalma genliği, kısalma ve gevşeme sürelerinin değişimleri değerlendirilmiştir.

    Aksiyon Potansiyeli Ölçümü (Akım Kenetleme Yöntemi): Kardiyomiyositler 1 Hz frekansında uyarılarak kayıt edilmiştir. Deneyde ekstraselüler ortam için içeriği (mM): NaCl 137, KCl 5.4, MgCl2 0.5, CaCl2 1.8, Hepes 11.8, glukoz 10 ve pH 7.40 olan Tyrode solüsyonu kullanılmıştır. Ayrıca, 1,5-2 MΩ dirence sahip pipetler içeriği (mM): K-aspartate 120, NaCl 10, KCl 20, K-Hepes 10, MgATP 5 ve pH 7.2 doldurulmuştur. Kaydedilen aksiyon potansiyellerinin (AP) dinlenim zar potansiyeli, genliği, depolarizasyon hızı ve repolarizasyon süresi hesaplanarak ortalama değerleri verilmiştir.

    Voltaj Kenetleme Yöntemi: Bütün akımlar voltaj kenetleme yönteminin tüm-hücre konfigürasyonunda kaydedilmiştir. Bunun için, hücrenin gigaohm düzeyinde bir direnç oluşturacak şekilde elektrot ucuna yapışması sağlandıktan sonra (gigaseal), 900 mV’luk bir puls uygulanarak hücre zarı kırılmıştır. Her potansiyel için elde edilen akım değerleri hücreler arası büyüklük değişiminden kaynaklanabilecek sapmaları önlemek amacıyla ölçüm yapılan hücrenin sığasına bölünerek değerlendirilmiş ve tüm akım değerleri akım yoğunluğunun (pA/pF) voltaja göre değişimi olarak verilmiştir. Akımların zamansal değişimler üssel fonksiyona uydurulmuştur (I/Imax=[1-exp(-t/Tau)]). Kanalların inaktivasyon değerleri Boltzmann denklemine uydurulmuştur (I/Imax=[1+exp(Vm–V1/2)/k]-1). Patch-clamp amplifikatörünün (Axon 200B, Digidata 1440, Axon Inc., ABD) voltaj kenetleme modunda 3 kHz’lik filtreden geçirilen akımlar, 20 kHz’lik örnekleme hızında bilgisayar yazılımı (pClamp 10) ile kaydedilmiştir. Kayıtlar için 2-3 MΩ’luk elektrodlar kullanılırken, kenetleme sonrası giriş direncinin 5 MΩ ve altında olması sağlanmıştır.

    Voltaja bağlı Na+ Kanal Akımnın Kaydedilmesi: Na+ kanal akımı (INa) ölçümleri için kullanılan pipet solüsyonu (mM): 120 CsCl2, 5 Na-ATP, 5 MgCl2, 10 TEA, 10 EGTA, 10 HEPES, 1 CaCl2 ve 0.3 LiCl2 (pH:7.2, CsOH) içeriğine sahiptir. Banyo solüsyonu olarak (mM): 120 NaCl, 10 TEA, 5 CsCl, 1 MgCl2, 10 glukoz, 10 HEPES, 1.5 CaCl2 ve 0.5 CdCl2 (pH:7.4, CsOH) içeriğe sahip solüsyon perfüzyon sistemi aracılığıyla hücrenin üzerine uygulanmıştır. Kayıt protokolünde tüm kanalların aktivasyonunu sağlamak için –120 mV değerinde 200 ms süreyle tutulmuştur. Sonra –100 mV’tan 5 mV’luk artışlarla +40 mV’a 200 ms’lik depolarize edici pulslar uygulanmıştır. Tepe değerleri ölçülüp 300 ms’den sonraki kuyruk akımları çıkarılmıştır. Akım reaktivasyon protokolu –30 mV’luk prepuls uygulandıktan sonra aynı potansiyele sahip ikinci puls uygulanmıştır. Pulslar arası zaman 1 ms’den başlayarak 2 ms’lik adımlarla 20 ms’ye kadar arttırılmıştır. Kanalların deaktivasyon kinetiğini incelemek için –120 ile +50 mV arasında 5 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak ve her adımı takiben, –30 mV’a kenetlenmiştir.

    L-tipi Ca2+ Kanal Akımının Kaydedilmesi: Voltaja bağlı L-tipi Ca2+ kanal akımları (ICaL) ölçümleri için kullanılan pipet solüsyonu (mM): 110 Cs-aspartat; 20 CsCl; 1 MgCl2; 5 fosfokreatin-Na2; 5 ATP-Na2; 10 EGTA ve 5 HEPES (pH:7,4, CsOH). Kayıt için, hücreler eğimli bir voltaj uygulaması ile zar potansiyeli –45 mV’a kenetlenmiş, bu seviyede bir süre beklenerek INa akımları inaktif hale getirilmiştir. Sonrasında –50 mV’tan 10 mV’luk artışlarla +60 mV’a 300 ms’lik depolarize edici pulslara cevaplar analiz edilmiştir. Kanalların inaktivasyon durumunu gözlemek için –80 mV ile +20 mV arasında 10 mV adımlarla 200 ms süreli prepuls uyguladıktan sonra zar her defasında yine 200 ms süreyle 0 mV’a kenetlenmiştir. Reaktivasyon ise; 200 ms süreyle 0 mV’a kenetlendikten sonra aynı potansiyelde ikinci puls uygulanarak kaydedilmiştir. Pulslar arası süre, 50 ms adımlarla, 50 ile 500 ms arasında değiştirilerek uygulanmıştır. Kanalların inaktivasyon kinetiğini incelemek için –70 ile +60 mV’lar arasında 10 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak 0 mV’luk ve 500 ms süreli ikinci bir puls uygulanmıştır. Akımların reaktivasyonları da iki aşamalı bir protokole göre kaydedilmiştir: 400 ms süreyle 0 mV’a kenetlemenin ardından 20 ms bekleyip aynı şekildeki ikinci puls uygulanmıştır. Δt=20 ms olmak üzere aynı protokol 300 ms’ye kadar uygulanarak ve her adımda ölçülen akımın tepe değeri maksimum akım değerine oranlanmıştır.

    K+ Akımlarının Ölçümü: Akım-voltaj karakteristiği 600 ms’lik pulslar 1 s’lik aralıklarla ve 10 mV’luk basamaklar şeklinde –120 mV’tan +70 mV’a kadar 14 defa uygulanmıştır. Bu akımlar için kullanılan çözeltiler banyo için (mM): 117 NaCl; 5.4 KCl; 1.8 CaCl2; 1.7 MgCl2; 10 Glukoz; 10 HEPES (pH:7.4, NaOH), pipet için ise (mM): 120 KCl; 6.8 MgCl2; 5 Na2ATP; 5 Na-phosphocreatine; 0.4 Na2GTP; 11 EGTA; 4.7 CaCl2; 20 HEPES ve CdCl2 (250 μM) (pH:7.2, KOH) olacak şekilde hazırlanmıştır. Akımların tepe değerinden 600 ms’lik pulsun son bölümündeki akım değerleri (Iss) çıkarılarak dışa doğru geçici potasyum akımı (Ito) hesaplanmıştır. Kanalların inaktivasyon kinetiğini incelemek için–70 ile +60 mV’lar arasında 10 mV’luk adımlarla prepuls uygulanarak +70 mV’luk ve 500 ms süreli ikinci bir puls uygulanmıştır. Akımların reaktivasyonları da iki aşamalı bir protokole göre kaydedilmiştir: -80 mV’taki zar potansiyeli 400 ms süreyle +70 mV’a kenetlenip tekrar başlangıç potansiyeline dönüldükten sonra 20 ms bekleyip aynı şekildeki ikinci puls uygulanmıştır. Δt =20 ms olmak üzere aynı protokol 300 ms’ye kadar uygulanmıştır. İlk pulsun akım değerine oranlanarak değerlendirilmiştir.

    İstatistiksel Analiz: Bu çalışmada, istatiksel karşılaştırma tekrarlı ölçüm Student’s t-test analizi ile değerlendirilmiştir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    Kardiyomiyositlerin işlevsel kasılma kinetikleri, elektrik alan altında uyarımı ile sarkomer boyu kısalma parametreleri ölçülerek değerlendirilmiştir. Şekil 1’de ölçülen kısalma parametrelerinin uyarı frekansına karşı ölçüm değerleri grafik olarak sunulmuştur. 20-HETE uygulaması sonrasında dinlenim durumunda kardiyomiyosit sarkomer boyları kontrol şartlarına göre 0.5 Hz uyarım altında azalmış, 4 Hz uyarımı altında yüksek bulunmuştur. Bu farklılık, kontrol şartlarında uyarı frekansı ile kısalan sarkomer boyu değişim paterninin 20-HETE uygulaması ile azalması nedeniyle olduğu görülmektedir (Şekil 1a). Kalbin sistolik işlevini değerlendirmek için kısalma parametreleri uyarım frekansına karşı gösterimi Şekil 1b’de özetlenmiştir. 20-HETE uygulaması sonrası sarkomer kısalma boyu uygulama öncesine göre ölçülebilen tüm frekanslarda anlamlı derecede düşmüştür. Aynı zamanda, kontrol koşulunda artan frekansa göre kısalma boylarında gözlenen düşüş 20-HETE uygulaması sonrası gözlenememiştir. Diğer yandan, 4 Hz uyarım frekansında hücrelerin uyarılamadığı gözlenmiştir. Bu nedenle, 4 Hz frekansında uygulama sonrası veriler verilememiştir. Kısalma kinetikleri incelendiğinde kasılma sürecinde (Şekil 1c) değişim gözlenmezken, 20-HETE uygulaması sonrası gevşeme sürecinin (Şekil 1d) kısaldığı görülmüştür.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: 20-HETE’nin sarkomerik kısalma parametreleri üzerine etkisi. Uyarılma frekansına bağlı olarak: a) dinlenim sarkomer boyu, b) kasılma boyu, c) % 90 kasılma süresi ve d) % 90 gevşeme süresi parametrelerini göstermektedir. *Uygulama öncesi ile karşılaştırıldığında (P≤0.005).

    Kasılmada yukarıda bahsedilen değişikliklerin olması uyarılma-kasılma çiftlenimi çerçevesinin bir diğer ayağı olan uyarılma kısmının incelenmesi gerekliliğini doğurmuştur. 20-HETE’nin AP üzerine olan etkisine bakıldığında, tepeye çıkış süresi ve repolarizasyon süresi bakımından bir etkisinin olmadığı bulgusuna ulaşılmıştır (Şekil 2c ve 2d). Bununla birlikte AP genliği (Tyrode: 96.64±8.06 mV, Tyrode+20-HETE: 70.81±4.99mV) üzerine azaltıcı bir etkisi olduğu ölçülmüştür (Şekil 2b). 20-HETE uygulaması bitirilip banyo solüsyonu ile yıkama yapıldığında ise genlik parametresinin başlangıç düzeyine ulaşamasa da arttığı gözlenmektedir (Şekil 2a).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: 20-HETE’nin kardiyak aksiyon potansiyeli üzerine etkisi. 1 Hz uyarılma frekansında meydana gelen aksiyon potansiyelinin a) genlik parametresinin zamana bağlı değişimi, b) AP genlik değerleri, c) tepeye çıkış süresi ve d)repolarizasyon süresini göstermektedir. * Uygulama öncesi ile karşılaştırıldığında (P≤0.005). APD90: Aksiyon potansiyeli repolarizasyon süresinin %90’lık süresi.

    AP üzerine olan etkilerini açıklayabilmek adına INa ve kinetikleri ölçüldüğünde 20-HETE’nin akım yoğunluğunu azalttığı gözlenmiştir (Şekil 3a). Maksimum akım yoğunluğunu gözlemlediğimiz potansiyeller için; Tyrode: 57.01 pA/pF’den Tyrode+20-HETE: 43.81 pA/pF’ye kadar azalma olduğu sonucuna ulaşılmıştır. INa kinetikleri incelendiğinde, 20-HETE uygulaması sonucunda deaktivasyon kinetiğinin daha negatif potansiyellere kaymasından dolayı kanalın daha erken bir şekilde kapanacağı (Şekil 3b ve Tablo 1), bununla birlikte 20-HETE uygulaması ile reaktivasyon kinetiğinin uzadığı, dolayısıyla kanalın daha geç açılacağı bulgusuna ulaşılmıştır (Şekil 3c ve Tablo 1).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 3: 20-HETE’nin voltaja bağımlı Na+ kanal akım yoğunluğu (INa) ve kanal kinetikleri üzerine etkisi. a) voltaja bağımlı Na+ kanalından ölçülen akım yoğunluğu-voltaj karakteristiği, b) potansiyel bağımlı kanal kinetiği olan deaktivasyon ve c) zaman bağımlı kanal kinetiği olan reaktivasyon parametrelerini göstermektedir. *Uygulama öncesi ile karşılaştırıldığında (P≤0.005). b ve c şekillerinde gösterilen deaktivasyon ve reaktivasyon kinetiklerinin matematiksel fit eğrilerinden hesaplanan LogEC50 ve zaman sabiti değerleri Tablo 1’de verilmiştir. INa (pA/pF): Voltaja-bağımlı Na+ kanalından ölçülen Na+ akım yoğunluğu.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: 20-HETE uygulaması öncesi (tyrode) ve 20-HETE uygulaması sonrası (tyrode+20-HETE) voltaja bağımlı Na+, K+ ve Ca2+ kanal akımları deaktivasyon ve reaktivasyon parametreleri

    AP repolarizasyon evresinin ilk kısmında (Faz 1) etkili Ito genliklerinde (Tyrode: 13.59 pA/pF, Tyrode+20-HETE: 9.47 pA/pF) azalmaya neden olmuştur (Şekil 4.A).Diğer yandan, Ito kinetikleri üzerine 20-HETE’nin bir etkisi gözlenmemiştir (Şekil 4c, 4d ve Tablo 1). Bununla birlikte, dinlenim zar potansiyelini ve AP repolarisazyon süresini doğrudan belirleyen Iss yoğunluğu ve içe doğrultucu K+ akımı yoğunluğu (IK1) üzerine 20-HETE uygulamasının bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir (Şekil 4.B). Şekil 4B’de görülen I-V karakteristiğinin –120 ve –50 mV arasında bulunan akım yoğunluğu değerleri IK1 hakkında bilgi vermektedir. ICaL yoğunluğu genliklerinde 20-HETE ICaL yoğunluğu genliklerinde bir azalışa neden olsa da bu değişim istatistiksel olarak anlamlı değildir (Şekil 5a). Bunun yanı sıra 20-HETE’nin kanal kinetikleri üzerine ise hiçbir etkisi olmadığı bulgusuna ulaşılmıştır. (Şekil 5b, 5c ve Tablo 1).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 4: 20-HETE’nin voltaja bağımlı K+ kanal akım (Ito ve Iss) yoğunluğu ve kanal kinetikleri üzerine etkisi. a) voltaja bağımlı K+ kanalından ölçülen geçici dışa doğru K+ akım yoğunluğu-voltaj karakteristiği, b) voltaja bağımlı K+ kanalından ölçülen düzgün kararlı K+ akım yoğunluğu-voltaj karakteristiği c) potansiyel bağımlı kanal kinetiği olan deaktivasyon ve d) zaman bağımlı kanal kinetiği olan reaktivasyon parametrelerini göstermektedir. *Uygulama öncesi ile karşılaştırıldığında (P≤0.005). c ve d şekillerinde gösterilen deaktivasyon ve reaktivasyon kinetiklerinin matematiksel fit eğrilerinden hesaplanan LogEC50 ve zaman sabiti değerleri Tablo 1’de verilmiştir. Ito (pA/pF): Voltaja-bağımlı K+ kanalından ölçülen dışarı doğrultucu geçici K+ akım yoğunluğu, Iss (pA/pF): Voltaja-bağımlı K+ kanalından ölçülen düzgün kararlı K+ akım yoğunluğu. İçeri doğrultucu K+ akımı (IK1), Iss eğrisinin içerisindeki -120 ile -50 mV arasındaki veriler hesaplanarak değerlendirilmiştir.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 5: 20-HETE’nin voltaja bağımlı Ca2+ kanal akım (ICaL) yoğunluğu ve kanal kinetikleri üzerine etkisi. a) voltaja bağımlı Ca2+ kanalından ölçülen akım yoğunluğu-voltaj karakteristiği. b) potansiyel bağımlı kanal kinetiği olan deaktivasyon ve c) zaman bağımlı kanal kinetiği olan reaktivasyon parametrelerini göstermektedir. *Uygulama öncesi ile karşılaştırıldığında (P≤0.005). b ve c şekillerinde gösterilen deaktivasyon ve reaktivasyon kinetiklerinin matematiksel fit eğrilerinden hesaplanan LogEC50 ve zaman sabiti değerleri Tablo 1’de verilmiştir. ICaL (pA/pF): Voltaja-bağımlı Ca2+ kanalından ölçülen L-tipi Ca2+ akım yoğunluğu.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Araşidonik asit’in fizyolojik olarak aktif metbolitleriden olan 20-HETE vasküler sistemi üzerine etkilerini inceleyen birçok araştırmaya konu olmasına karşın kardiyomiyosit işlevine yönelik araştırmalar kısıtlı düzeyde kalmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda çeşitli kardiyovasküler patolojiler de koruyucu yönde etkisi bildirilirken 13,14, hastalıkların patogenezinde rol aldığı gibi etkiler de raporlanmıştır 7,15.

    Bu çalışma, 20-HETE’nin kardiyomiyosit uyarılma-kasılma çiftlenimi üzerine etkilerinin ilk kanıtlarını sunmaktadır. 20-HETE hem kasılma hem de uyarılma parametrelerine akut inkübasyon ile önemli etkileri olduğu gözlenmiştir. Bu yargıya, elektrik alan altında gözlenen kısalma parametreleri ve voltaj kenetleme ile kaydedilen akımların sonuçları incelendiğinde ulaşılmaktadır. Ancak, bu etkilerin tümünü açıklamak ve karşılaştırabilmek için literatürde yeterli bilgi bulunmamaktadır.

    Sıçan kalbi miyositlerinde kasılma parametre sonuçlarında ilk göze çarpan verinin 20-HETE perfüzyonu sonucu 4 Hz frekansında uyarıma cevabın oluşmamasıdır (Şekil 1). Uygulama sonrası INa kinetiklerinde gözlenen ciddi değişim (Şekil 3) sonucu frekansın artması ile AP oluşumunun sekteye uğraması olarak açıklayabiliriz. İnaktivasyonun negatif zar potansiyellerine kayması ve ek olarak reaktivasyon kinetiğinin yavaşlaması (Şekil 3b ve c, Tablo 1) Na+ kanallarının yeniden aktivasyonunu geciktirecektir. Bunun da belirli frekanslarda ardışık AP oluşumunu engelleyeceği düşünülmektedir. Bu bulguların yanında, dinlenim sarkomer boyu ve kısalma genliklerinde görülen frekansa bağlı azalmanın (Şekil 1a ve b) 20-HETE uygulaması sonucu kaybolması dikkat çeken bir durumdur. Bu olgu kasılma makinesinde Ca2+ duyarlılığında gerçekleşen azalmanın sonucu olarak değerlendirilebilir. Aynı zamanda gevşeme süresinde görülen yavaşlama bu olguyu desteklemektedir. Diğer yandan, ICaL yoğunluğunda, istatiksel olarak anlamlı olmasa da, gözlenen azalmanın geçici hücre içi cevaplarında azalmaya yol açacağı göz önüne alınmalıdır. Dolayısıyla, kalbin sempatik uyarım altında savaş ya da kaç cevabını etkileyerek adaptif mekanizmanın oluşmasını engelleyecektir.

    20-HETE’nin kasılma parametrelerinde gözlenen olumsuzlukları yanında, AP genliğini azaltıcı yönde olduğu bilgisi de bulgularımız arasındadır (Şekil 2a ve b). AP’yi bu şekilde etkileyebilecek durumun INa ve IK değişiklikleri ile olabileceği literatürde birçok defa gösterilmiştir. INa’nın akım yoğunluğunda ki azalış AP genliğini etkileyen temel faktördür (Şekil 3a). Bu durum iki şekilde olabilmektedir; açılabilir voltaja-bağımlı kanal sayısında azalma veya kanal kinetiklerinde yavaşlama. Ölçümlerimiz sonucunda reaktivasyon kinetiğinin uzadığı ve deaktivasyon kinetiği eğrisinin de daha negatif potansiyele doğru yönlendiği bulgularına ulaştık. Reaktivasyon kinetiğinin uzaması kanalın yeniden aktive olabilmesi için daha uzun sürenin geçmesi gerektiğini ve maksimum geçirgenliğe daha geç gelebileceğini göstermektedir. Öte yandan deaktivasyon kinetiğinin daha negatif potansiyele kayması da kanalın daha erken inaktivasyon durumuna girebileceğini söylemektedir. Dolayısıyla kanal daha kısa süre açık kalabilecektir. Bu verilerin yanında Ito akım genliklerinde gözlenen azalma da hücre içerisindeki pozitif yük sayısının artışına neden olacağından, iyon dengesini değiştirecek ve hücre içerisine doğru Na+ girişinde azalama gözlenecektir. Na+’da AP genliğinin oluşmasında ki başat iyon olmasından dolayı da AP genliğinde düşme gözlenecektir. AP repolarizayon süresinde bir değişimin olmaması da elde edilen veriler ışığında açıklanabilir bir durum olarak değerlendirilebilir. Ito yoğunluğunda ki azalmanın dışında; kinetiğinin, Iss ve IK1 yoğunluklarında bir değişiminin olmaması ve görece ICaL yoğunluğunda gözlenen azalma AP repolarizayon süresinde bir farklılığın gözlemlenmemesinin altında yatan nedenlerdir. Diğer yandan, ICaL yoğunluğunda gözlediğimiz 20-HETE etkisini karşılaştırabileceğimiz çalışmada 16 bu akımın arttığı yönünde bulgular sunulmuştur. Ancak, bu çalışmada kontrol koşullarında elde edilen ICaL’nın çok düşük (200 pA) olması nedeniyle 20-HETE perfüzyonun bu akımları artırmış gibi göründüğü düşünülmektedir. Bu nedenle, çalışmamızın sonucunda ulaştığımız yargının daha gerçekçi veriler sunduğunu düşünmekteyiz.

    Kardiyak elektrofizyoloji üzerine 20-HETE’nin etkilerini ortaya koyan çalışmaların hem çelişkili hem de yeterli sayıda olmaması bu konunun tek bir yöne doğru yoğun bir şekilde incelenmesini zorlaştırmaktadır. Ancak bu çalışmada, 20-HETE’nin kardiyomiyositlerin hem uyarılma hem de kasılma işlevleri üzerine etkisini bütünsel bir şekilde ele alarak literatüre önemli katkı sunmaktadır. Diğer yandan, hücre boyutunda ve akut olarak gerçekleştirilen çalışmamızın sonuçlarının tüm sistem ve uzun süreli etkilerini bu sonuçlardan elde etmek hatalı olacaktır. Bu nedenle, 20-HETE’nin kardiyak doku üzerine etkisinin elektrofizyolojik ve moleküler olarak daha kapsamlı çalışmalarla incelenmesi bir bütünlük çerçevesinde molekülün fizyolojik etkileri daha net bir şekilde ortaya konulabilecektir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Sun CW, Alonso-Galicia M, Taheri MR, et al. Nitric oxide-20-hydroxyeicosatetraenoic acid interaction in the regulation of K+ channel activity and vascular tone in renal arterioles. Circ Res 1998; 83: 1069-1079.

    2) Ito O, Nakamura Y, Tan L, et al. Expression of cytochrome P-450 4 enzymes in the kidney and liver: regulation by PPAR and species-difference between rat and human. Mol Cell Biochem 2006; 284: 141-148.

    3) Zordoky BN, Aboutabl ME, El-Kadi AO. Modulation of cytochrome P450 gene expression and arachidonic acid metabolism during isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in rats. Drug Metab Dispos 2008; 36: 2277-2286.

    4) Lv X, Wan J, Yang J, et al. Cytochrome P450 omega-hydroxylase inhibition reduces cardiomyocyte apoptosis via activation of ERK1/2 signaling in rat myocardial ischemia-reperfusion. Eur J Pharmacol 2008; 596: 118-126.

    5) Kroetz DL, Zeldin DC. Cytochrome P450 pathways of arachidonic acid metabolism, Curr Opin Lipidol 2002; 13: 273-283.

    6) Gross ER, Nithipatikom K, Hsu AK, et al. Cytochrome P450 omega-hydroxylase inhibition reduces infarct size during reperfusion via the sarcolemmal KATP channel. J Mol Cell Cardiol 2004; 37: 1245-1249.

    7) Bao Y, Wang X, Li W, et al. 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid induces apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes through mitochondrial-dependent pathways. J Cardiovasc Pharmacol 2011; 57: 294-301.

    8) Certikova Chabova V, Walkowska A, Kompanowska-Jezierska E, et al. Combined inhibition of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid formation and of epoxyeicosatrienoic acids degradation attenuates hypertension and hypertension-induced end-organ damage in Ren-2 transgenic rats. Clin Sci (Lond) 2010; 118: 617-632.

    9) Yousif MH, Benter IF, Roma RJ. Cytochrome P450 metabolites of arachidonic acid play a role in the enhanced cardiac dysfunction in diabetic rats following ischaemic reperfusion injury. Auton Autacoid Pharmacol 2009; 29: 33-41.

    10) Althurwi HN, Maayah ZH, Elshenawy OH, El-Kadi AO. Early changes in cytochrome P450s and their associated arachidonic acid metabolites play a crucial role in the initiation of cardiac hypertrophy induced by isoproterenol. Drug Metab Dispos 2015; 43: 1254-1266.

    11) Elkhatali S, El-Sherbeni AA, Elshenawy OH, Abdelhamid G, El-Kadi AO. 19-Hydroxyeicosatetraenoic acid and isoniazid protect against angiotensin II-induced cardiac hypertrophy. Toxicol Appl Pharmacol 2015; 289: 550-559.

    12) Alsaad AM, BZordoky BN, Tse MM, El-Kadi AO. Role of cytochrome P450-mediated arachidonic acid metabolites in the pathogenesis of cardiac hypertrophy. Drug Metab Rev 2013; 45: 173-195.

    13) BodigaS, Zhang R, Jacobs DE, et al. Protective actions of epoxyeicosatrienoic acid: dual targeting of cardiovascular PI3K and KATP channels. J Mol Cell Cardiol 2009; 46: 978-988.

    14) Bodiga S, Gruenloh SK, Gao Y, et al. 20-HETE-induced nitric oxide production in pulmonary artery endothelial cells is mediated by NADPH oxidase, H2O2, and PI3-kinase/Akt. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2010; 298: L564-574.

    15) Baines CP, Molkentin JD. STRESS signaling pathways that modulate cardiac myocyte apoptosis. J Mol Cell Cardiol 2005; 38: 47-62.

    16) Zheng Q, Han Y, Bao Y, et al. 20-HETE increases NADPH oxidase-derived ROS production and stimulates the L-type Ca2+ channel via a PKC-dependent mechanism in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2010; 299: 1109-1117.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
    [ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]