Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada 3 aylık erkek wistar türü sıçan kalplerinden izole edilen ventriküler miyositler kullanıldı. Patch clamp amplifikatörünün akım kenetleme modu kullanılarak 1 Hz frekans uyaranlarıyla aksiyon potansiyelleri (AP) elde edildi. Potasyum ve kalsiyum akımları, tüm hücre konfigürasyonu kullanılarak kaydedildi.

Bulgular: Rosuvastatinin (1-10 μM) AP repolarizasyon süresini doza bağımlı bir şekilde uzattığı gözlendi (n=15-16, sırasıyla). Repolarize edici akımlar için rosuvastatinin, L tipi kalsiyum akımlarını (I_CaL) %14.57 ve %17.75 azalmayla sonuçlanırken (n=10), geçici-dışa doğru potasyum akımındaki (I_to) azalma sırasıyla %8.28 ve %27.59 idi (n=10). Kararlı durum K⁺ akımı (I_ss) önemli ölçüde değişmedi. Ayrıca, her iki akımın inaktivasyon zamanı sabitleri analiz edildi ve rosuvastatinin, Ito akımlarının yavaş bileşenini önemli ölçüde azalttı, buna karşın ICaL'nin inaktivasyon zaman sabitlerini etkilemedi.

Sonuç: Rosuvastatinin, AP'nin repolarizasyonu sırasında rol oynayan fakat süre üzerinde zıt etkileri olan I_to ve I_CaL akımlarının genliği azaltmasına rağmen, süre anlamlı olarak uzamıştır. Bu durumda I_to'daki azalmanın, I_CaL’deki azalmanın AP süresi üzerindeki karşıt etkisini baskıladığı ve repolarizasyon süresini uzattığı söylenebilir.

Bu kapsamda vasküler duvardaki trombojenik cevapları inhibe eder, oksidatif stress ve inflamasyonu azaltır, aterosklerotik plak stabilitesini artırır ve endotelyal fonksiyon düzenlenmesini indükler. Bu pleiotrofik etkilerini çoğunlukla GTPazların prenilasyonunun inhibisyonu vasıtasıyla gerçekleştirmektedir. GTPazlar birçok hücresel süreçte görev almaktadırlar. Statinlerin kolestrolden bağımsız etkileri, farnesilpirofosfat ve geranilpirofosfat gibi isoprenoid ara ürünlerin sentezini engelleme yeteneği ile sağlanır. Küçük GTP’ye bağlanan Rho, Ras ve Rac proteinlerin inhibisyonu statinlerin biyolojik etkilerine aracılık etmede önemli bir role sahiptir ⁵.

Statinlerin ventriküler aritmi ve atriyal fibrilasyon riskini azaltabildiği ve normal kolesterolemik koşullar altında bile kardiyovasküler hastalıklara sahip kişilerde morbidite ve mortalite oranlarını düşürdüğü ileri sürülmüştür ^6,7. Bu bulgular statinlerin, iskemi ve hipertrofi gibi kalp hasarı oluşturulan modellerde sarkoplazmik retikulum Ca²⁺-ATPase (SERCA) ve ryanodin reseptörleri (RyR) gibi kalsiyum düzenleyici proteinler ve kasılma fonksiyonlarını etkilediğini ve apoptotik hücre ölümünü azalttığını gösteren deneysel bulgularla da desteklenmiştir ⁸.

Daha önce bazı statinlerin atrial miyositlerin K⁺ ve L-tipi Ca²⁺ kanal akımlarını (I_CaL), aksiyon potansiyelini (AP) ve AP süresini (APD) akut uygulamada değiştirdikleri gösterilmiştir ⁹. Başka bir çalışmada ¹⁰ statinlerin, transmembran iyon kanallarının özelliklerinin değişimi sonucu ventriküler iletim ve uyarılabilirliğini etkilediği bulunmuştur. Bununla birlikte, statinlerin ventriküler aritmi gelişimine katkıda bulunduğu bilinen intrasellüler aşırı Ca²⁺ yüklenmesi ve sarkoplazmik retikulum hasarına yol açan iskemi-indüklü oksidatif stresi azalttığı kanıtlanmıştır ¹¹. Hiperkolesterolemi geçmişi olan tavşanlarda yapılan bir çalışmada pravastatin tedavisinin endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) aracılı kardiyak ATP duyarlı K⁺ kanalları üzerine etki ederek hipertrofiyi engellediği gösterilmiştir ¹². Başka bir çalışmada ise tavuk kardiyak hücrelerinde tedavide kullanılan dozdan daha yüksek konsantrasyonda lovastatin uygulamasının ICaL’i inhibe ettiği gösterilmiştir ¹³. Fare ventrikül hücrelerinde yapılan başka bir çalışmada AP plato fazında görevli ICaL, Kv1.5 ve Kv4.3 akımlarını atorvastatin ve simvastatinin nasıl etkilediği incelenmiş, simvastatinin ICaL akımlarını bloke ettiği ve nanomolar konsantrasyonlarda atorvastatin APD’yi uzatırken, simvastatinin kısalttığını bulmuşlardır ⁹.

Hidrofilik yapıda üçüncü jenerasyon sentetik bir statin olan rosuvastatin (RSV), hiperkolesterolemi tedavisinde kullanılmasına karşın normokolesterolemik durumda da anti-inflamatuar özellikleri gösterilmiştir. Yapılan çalışmalarda lökosit adhezyonunu azalttığı, trombosit agregasyonunu engellediği, santral kan akımının düzenlemesinde rol oynadığı iddia edilen RSV’nin antioksidatif ve kardiyovasküler koruyucu sonuçları da içeren bir takım pleiotrofik etkiler gösterdiği tespit edilmiştir ¹⁴. Bunun yanı sıra, RSV’nin ve atrovastatinin, anti-aritmik özelliklere de sahip olduğu gösterilmiştir ¹⁵.

Özetle, statinlerin genel olarak kardiyak iyon kanalları üzerine etkisini gösteren çalışmaların sınırlı olmasının yanında, özellikle RSV’nin kalp kası üzerine elektrofizyolojik etkisini gösteren bir çalışmaya rastlanmamıştır. Hormonlar, ilaçlar veya metabolizmada meydana gelen bir değişim bu akımları etkileyeceği ¹⁶ göz önüne alınarak RSV’nin de kalp kasının elektrofizyolojik özelliklerini etkileyerek iyon akımları üzerine doğrudan etki etmesi beklenmektedir. Bu çalışmada amacımız, RSV’nin iyonik akımlar ve AP üzerine etkilerini ortaya koymaktır.

Hücre İzolasyonu: Sıçanların kalpleri anestezi altında (sodyum pentobarbital 50 mg/kg) hızlı bir şekilde çıkarıldıktan sonra Langendorff sistemine bağlandı. Perfüzyon sistemine asılan kalpler önce kalsiyumsuz perfüzyon solüsyonu (mM: 137 NaCl; 5.4 KCl; 1.2 MgSO₄; 1.2 KH₂PO₄; 5.8 HEPES; 20 glikoz olan ve pH 7.2 dengesinin sağlanması için %95 O2-%5 CO₂ ile gazlanan) ile 5 dakika yıkandı. Daha sonra, kalbin üzerinden 20-25 dakika süresince aynı solüsyon içinde hazırlanan 0.7 mg/mL kollajenaz (Collagenase A Roche) ve 0.05 mg/mL proteaz (Sigma tipi XIV) karışımı geçirilip uygun kıvama ulaşıldığında, sol ventrikül küçük bir kabın içine alındı ve makasla ince bir şekilde dilimlendi. Hücreler 100 μm’lik ince bir filtreden geçirilerek bir tüpün içerisine alındıktan sonra birkaç yıkama işleminden geçirildi. Ortamdaki hücrelerin Ca²⁺ adaptasyonu yaklaşık 5 dakikalık zaman aralıkları ile kademeli artışlarla sağlandı ve yaklaşık bir saat dinlendirildikten sonra elektrofizyolojik deneylerin uygulamasına geçildi.

Elektrofizyolojik Kayıtlar: Akımlar ve AP’ler patch-clamp amplifikatörünün tüm hücre konfigürasyonuyla kaydedildi. AP, amfi akım kenetleme modunda iken miyositlerin 1Hz frekansındaki 1-3 ms’lik akım pulsları ile uyarılmasıyla elde edildi. Elde edilen AP’lerin repolarizasyon fazlarının %25,50,75,90’a (APD25,50,75,90) ulaşma süreleri değerlendirildi. ICaL kaydı için, membran potansiyeli –70 mV düzeyinde kenetlenen hücrelere –45 mV’luk ön-puls uygulanarak Na+ akımları inaktif duruma getirildikten sonra, 0 mV seviyesinde 300 ms depolarizasyon pulsu uygulandı. Her uygulama öncesinde kararlı yanıt alınıncaya kadar kayıtlar tekrarlandı ve kararlı yanıtı takiben RSV uygulamasına geçildi. Böylece ilaçtan bağımsız olarak akımda zamana bağlı olarak ortaya çıkabilecek değişiklikler (run-down gibi) bertaraf edildi. ICaL genliği, maksimum akım ve pulsun sonundaki akım arasındaki fark alınarak hesaplandı. Akım yoğunluğu, hücrenin akım değeri ölçüm yapılan hücrenin kapasitansına bölünerek hesaplandı. Geçici dışarı-doğru K⁺ akım (I_to) ölçülümü için dinlenim zar potansiyeli –70 mV düzeyinde kenetlenen hücrelere +60 mV değerinde 3 s’lik depolarizasyon pulsu uygulanarak kaydedildi. Ito'nun genliği, akımların tepe değerlerinden 3 s’lik pulsun son bölümündeki akım değerleri çıkarılarak hesaplandı. Daha sonra akımların değeri hücre kapasitansına bölünerek akım yoğunluğu hesaplandı.

Solüsyonlar ve Kimyasallar: Patch-clamp deneylerinde hücreler normal tyrode çözeltisi (mM): 137 NaCl, 5.4 KCl, 0.5 MgCl₂, 1.5 CaCl₂, 11.8 HEPES ve 10 glikoz, pH:7.40 ile perfüze edildi. Tüm hücre patch-clamp için pipet solüsyonu içeriği (mM): 120 Kaspartate, 20 KCl, 10 NaCl, 10 K-HEPES, 5 MgATP (pH: 7.2). Bununla birlikte I_CaL ölçümleri için, K⁺ pipet ve dış solüsyonda Cs⁺ ile değerlendirildi ve 10 mM EGTA eklendi. K⁺ akımı kaydı sırasında Ca²⁺ akımları 250 μM kadmiyum klorür ile bloke edildi. RSV (AstraZeneca) DMSO içerisinde çözüldü, burada deneysel çözeltilerdeki DMSO'nun son dilüsyonunun %0.01’den küçük olmasına özen gösterildi.

İstatistiksel Yöntem: Veriler Clampfit 10.2 yazılımı kullanılarak analiz edilmiş ve sonuçlar ortalama±SEM olarak sunuldu. Tüm istatistiksel karşılaştırmalar Graphpad-Prism programında analiz edildi. Grupların karşılaştırılması için eşleştirilmiş örneklem (paired) t-testi uygulandı ve P değerlerinin 0.05’ten küçük olması anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: RSV’nin ventriküler miyositlerin APD üzerine etkisi. AP repolarizasyon süresinde 1 μM ya da 10 μM RSV'nin uygulanmasıyla konsantrasyona bağlı artış belirlendi. APD'deki değişikliklerin derecesi repolarizasyonun %25, %50, %75 ve %90’ına ulaşma süresi (APD25, APD50, APD75 ve APD90) olarak ölçüldü. Veriler ortalama±SEM şeklinde verilmiştir (*P<0.05 vs Kontrol değeri, n=15- 16).

İkinci aşamada AP’nin repolarizasyon fazında gözlenen bu uzamanın hangi iyonik akımlardaki değişikliklerden kaynaklandığını belirlemek için deneyler tasarlandı. Sıçan AP’sinde repolarizasyon süreci temel olarak K⁺ akımları ve ICaL akımlarıyla ilişkili olduğundan, RSV’nin bu akımlar üzerine etkisi araştırıldı.

Bir tip K⁺ akımı olan Ito akımında anlamlı bir azalma olduğu ve azalma miktarının uygulanan RSV’nin dozuna bağlı olarak sırasıyla %8.28 ve %27.59 olduğu belirlendi (n=10). Pulsun sonundan ölçülen kararlı durum K⁺-akımları (I_ss) ise RSV uygulamasıyla anlamlı bir değişim göstermedi. Şekil 2’de I_to akımında RSV’nin uygulanan dozuna bağlı değişim gösterildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: RSV uygulaması, Ito konsantrasyona bağlı azalmayla sonuçlandı. Sol panel, Ito akımındaki yüzde azalmayı ve sağ panel, RSV'nin yokluğunda ve varlığında zamanın bir fonksiyonu olarak Ito’daki azalmanın durumunu göstermektedir. Akımlar depolarizan pulsun +60 mV'ye kenetlendiği 3 s süreli protokol ile kaydedildi. Veriler ortalama±SEM olarak verilmiştir. *P<0.05 vs. bazal kontrol değerleri (n= 10 kayıt).

Ayrıca, Şekil 3’te gösterildiği gibi K⁺ akımlarının altında yatan geçici dışa doğru K akımlarının hızlı ve yavaş bileşenleri (I_to,fast, I_to,slow) ve I_ss tanımlamak için +60mV’da akımın azalma fazı eksponansiyel bir fonksiyona fit edildi ^17,18. Bu işlemin sonucunda I_fast, I_slow ve I_ss akım bileşenlerinin genlikleri olan Afast, Aslow ve Ass hesaplandı. Daha sonra, azalma fazının hızlı ve yavaş zaman sabitleri belirlendi. 10 μM RSV uygulaması, I_to,fast ve I_to,slow bileşenlerinin genliklerinde sırasıyla %38.31 ve %21.82 oranında bir azalmaya neden olurken, I_ss genliğinde %19.78 oranında bir artışa neden oldu (n=10). I_to,fast’de belirgin bir azalma meydana gelmesine rağmen I_ss bileşenindeki artış anlamlı seviyeye ulaşmadı. Zaman sabiti açısından bakıldığında, kontrol ve 10 μM RSV uygulaması yavaş zaman sabitini anlamlı olarak azaltırken, hızlı zaman sabitindeki azalmanın ise anlamlı seviyede olmadığı belirlendi (kontrol ve RSV uygulaması, yavaş zaman sabitini 678.74±63.98 ms’den 563.62±46.47 ms’ye hızlı zaman sabitini 19.67±2.74 ms’den 18.66±2.15 ms’ye, n=10 ve P<0.05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: +60 mV'de 3 s’lik puls ile elde edilen K+ akım trasesinin azalma fazı iki terimli üstel fonksiyon ve akımın sonundaki inaktive olmayan bir bileşenle temsil edildi. Hızlı, yavaş ve kararlı durumdaki akımların ortalama genlik değerleri Afast, Aslow, Ass olarak verilmiş, buna karşılık inaktivasyon zaman sabitleri hızlı ve yavaş olmak üzere iki terimle ifade edilmiştir. Veriler ortalama±SEM olarak verilmiştir. *P<0.05 vs. bazal kontrol değerleri (n= 10 kayıt).

Son olarak, RSV’nin kardiyak AP repolarizasyon fazında etkili diğer bir akım olan I_CaL üzerine etkisini incelendi. Şekil 4’te görüldüğü gibi bu akımın RSV uygulamasını takiben doza bağlı olarak %14.57 ve %17.75 oranında azaldığı tespit edildi (n=15). Buna karşılık RSV I_CaL'nin inaktivasyon zaman sabitlerini etkilemedi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: RSV, ICaL üzerine doz bağımlı etkisi. Sağ panel, RSV yokluğunda ve varlığında zamanın bir fonksiyonu olarak ICaL, genliğindeki azalma. Sol panel, 1 μM ve 10 μM RSV ile yıkandıktan sonra ICaL genliğindeki yüzde değişim. Veriler ortalama ± SEM olarak verilmiştir. *P<0.05 vs. bazal kontrol değerleri (n=15 kayıt).

1) Nolan JA, Skuse P, Govindarajan K, et al. The influence of rosuvastatin on the gastrointestinal microbiota and host gene expression profiles. Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol 2017; 312: G488-497.

2) Mital S, Liao JK. Statins and the myocardium. Semin Vasc Med 2004; 4: 377-384.

3) Keating GM, Robinson DM. Rosuvastatin: A review of its effect on atherosclerosis. Am J Cardiovasc Drugs 2008; 8: 127-146.

4) Zhou R, Ma P, Xiong A, et al. Protective effects of low-dose rosuvastatin on isoproterenol-induced chronic heart failure in rats by regulation of DDAH-ADMA-NO pathway. Cardiovasc Ther 2017; 35: e12241.

5) Takemoto M, Liao JK. Pleiotropic effects of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors. Arterioscler. Thromb Vasc Biol 2001; 21: 1712-1719.

6) Zheng X, Hu SJ. Effects of simvastatin on cardiac performance and expression of sarcoplasmic reticular calcium regulatory proteins in rat heart. Acta Pharmacol Sin 2005; 26: 696-704.

7) Lev ne GN, Keaney JF, V ta JA. Cholesterol reduct on n card ovascular d sease Cl n cal Benef ts and Poss ble Mechanisms. N Engl J Med 1995; 332: 512-521.

8) Kang L, Fang Q, Hu SJ. Regulation of phospholamban and sarcoplasmic reticulum Ca 2+-ATPase by atorvastatin: Implication for cardiac hypertrophy. Arch Pharm Res 2007; 30: 596-602.

9) Vaquero M, Caballero R, Gómez R, et al. Effects of atorvastatin and simvastatin on atrial plateau currents. J Mol Cell Cardiol 2007; 42: 931-945.

10) Schulz R. Pleiotropic effects of statins: Acutely good, but chronically bad? J Am Coll Cardiol 2005; 45: 1292-1294.

11) Tavackoli S, Ashitkov T, Hu Z-Y, et al. Simvastatin-induced myocardial protection against ischemia–reperfusion injury is mediated by activation of ATP-sensitive K+ channels. Coron Artery Dis 2004; 15: 53-58.

12) Lee TM, Lin MS, Chou TF, Tsai CH, Chang NC. Effect of pravastatin on left ventricular mass by activation of myocardial KATP channels in hypercholesterolemic rabbits. Atherosclerosis 2004; 176: 273-278.

13) Renaud JF, Schmid A, Romey G, Nano JL, Lazdunski M. Mevinolin, an inhibitor of cholesterol biosynthesis, drastically depresses Ca2+ channel activity and uncouples excitation from contraction in cardiac cells in culture. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 8007-8011.

14) Mahalwar R, Khanna D. Pleiotropic antioxidant potential of rosuvastatin in preventing cardiovascular disorders. Eur J Pharmacol 2013; 711: 57-62.

15) Ikeda Y, Young LH, Lefer AM. Rosuvastatin, a new HMG-CoA reductase inhibitor, protects ischemic reperfused myocardium in normocholesterolemic rats. J Cardiovasc Pharmacol 2003; 41: 649-656.

16) Carmeliet E. K+channels and control of ventricular repolarization in the heart. Fundam Clin Pharmacol 1993; 7: 19-28.

17) Xu H, Guo W, Nerbonne JM. Four kinetically distinct depolarization-activated K+ currents in adult mouse ventricular myocytes. J Gen Physiol 1999; 113: 661-677.

18) Ozturk N, Yaras N, Ozmen A, Ozdemir S. Long-term administration of rosuvastatin prevents contractile and electrical remodelling of diabetic rat heart. J Bioenerg Biomembr 2013; 45: 343-352.

19) Nerbonne JM, Kass RS. Molecular physiology of cardiac repolarization [Internet]. Physiol Rev 2005; 85: 1205-1253.

20) Tamargo J, Caballero R, Gómez R, Valenzuela C, Delpón E. Pharmacology of cardiac potassium channels [Internet]. Cardiovasc Res 2004; 62: 9-33.

21) Plante I, Vigneault P, Drolet B, Turgeon J. Rosuvastatin blocks hERG current and prolongs cardiac repolarization. J Pharm Sci 2012; 101: 868-878.

22) Feng PF, Zhang B, Zhao L, et al. Intracellular Mechanism of Rosuvastatin-Induced Decrease in Mature hERG Protein Expression on Membrane. Mol Pharm 2019; 16: 1477-1488.

23) Sun X, Xu D, Li L, Shan B. Effects of rosuvastatin on post-infarction cardiac function and its correlation with serum cytokine level. Int J Clin Exp Med 2017; 10: 10690-10696.