İlk olarak 1974 yılında elektron mikroskobu ile teşhis edilen ve buzağı ishallerinin en önemli viral etkenlerinden bovine rotavirüs (BRV)’ler, Reoviridae ailesi içerisinde Rotavirus genusunda sınıflandırılan, zarfsız, kübik simetrili, çift iplikçikli ve 11 segmentli RNA genomuna sahip olan virüslerdir ². İnsan dahil birçok memeli ve kanatlı hayvan türünde enfeksiyon oluşturan rotavirüsler erişkinlerde subklinik, yenidoğanlarda (özellikle de immun kolosturum almamış olanlarda) ishal ile seyreden hastalıklara neden olmaktadır ³.

Bovine rotavirüs (BRV)’ler esas olarak fekal-oral yolla bulaşmakta ve subklinik erişkin hayvanlar bu aşamada önemli rol oynamaktadır ⁴. Enfekte hayvanlar bol miktarda virüsü dışkıları ile çevreye saçar ve bu saçılım enfeksiyonun 3. ve 4. günlerinde en üst seviyeye ulaşır. Bu nedenle BRV ile enfekte semptomatik buzağıların dışkısı çevresel kontaminasyon için risk oluşturmakta ve rotavirüsle enfekte su kaynakları hastalığın epidemiyolojisine doğrudan katkıda bulunmaktadır ³.

Yenidoğan buzağı ishallerinin önemli etkenlerinden bir diğeri olan bovine coronavirüsler, Nidovirales dizininde, Coronaviridae ailesinde, Coronavirinae alt ailesinde, Betacoronavirus genusunda yer alırlar ve zarflı, helikal simetrili, pozitif polariteli olan RNA virüsleridir ⁵. Coronavirüsler insan, evcil ve vahşi yaşamdaki birçok hayvan türünde enfeksiyon oluşturarak akut ve kronik sindirim, solunum ve merkezi sinir sistemi hastalıklarına neden olmakta ⁶ ve tür bariyerini geçerek zoonoz hastalıklar oluşturabilmektedir ⁷. BCoV’lar da BRV’lere benzer şekilde başlıca fekal-oral yolla bulaşmakta, kontamine olmuş yem ve su kaynakları virüsün taşınmasında önemli rol oynamaktadır. Etken ayrıca aerosol yolla da bulaşabilmektedir ^3,6.

BRV ve BCoV antijenlerinin saptanmasında birçok araştırıcı tarafından kullanılan yöntem ELISA tekniğidir. Yine bu etkenlerin tespitinde en çok tercih edilen yöntemlerin başında sensitivite ve spesifitesi yüksek olan reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ve Real Time RT-PCR (rRT-PCR) gibi moleküler teknikler de kullanılmaktadır ^8,9.

Türkiye’nin farklı bölgelerinde yenidoğan buzağı ishallerinde farklı oranlarda BRV ve BCoV tespiti yapılarak koruyucu veteriner hekimlik hizmetlerinin uygulandığı çiftliklerde dahil her iki enterik virüsün yenidoğan buzağılarda ishale neden olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada yenidoğan buzağı ishallerinin sıklıkla görüldüğü Elazığ, Diyarbakır ve Malatya illerinden dışkı örneklerinde BRV ve BCoV varlığının real-time PCR yöntemi ile araştırılması ve bu virüslere yönelik korunma-kontrol programlarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır.

İshal Örneklerinin Toplanması ve İşlenmesi: Bu çalışmada Elazığ, Diyarbakır ve Malatya illerinde faaliyet gösteren küçük/orta büyüklükteki işletmelerde yetiştirilen toplam 74 ishalli buzağıya (1-28 günlük yaş) ait dışkı örneği alındı. Bu örnekler analiz edilinceye kadar -20°C’de saklandı. Dışkı örnekleri, PBS (Phosphate Buffer Saline) ile %10-20 oranında süspanse edilerek iyice vortekslenip, +4 ºC’de, 3000 rpm’de, 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatantlar yeni steril tüplere alındı. Bu süpernatantlardan 250 μL alınarak (RNAase free) steril 1.5 mL’lik tüplere aktarıldı. Geriye kalan miktarlar ise tüpler içerisinde -80 ºC’de muhafaza edildi. Örnek alınan buzağılara ait bazı bilgiler Tablo 2’de verilmiştir.

Viral Nükleik Asit İzolasyonu ve Real-Time RT-PCR: Dışkıdan hazırlanan süpernatantlardan viral etkenlerin RNA’sı talimatlarına uygun olarak IndiSpin Pathogen Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Almanya, Cat. No: SP54106) ile elde edildi ve analiz edilinceye kadar –80 ºC’de muhafaza edildi.

Klinik örneklerin rRT-PCR adımında ise AgPath-ID™ One-Step RT-PCR (Thermo Scientific™, Amerika Birleşik Devletleri) kiti kullanıldı.

Araştırmada bovine rotavirüs ve bovine coronavirüsün hedef gen bölgelerinin çoğaltılması aşamasında kullanılan primer ve problar Tablo 1’de gösterilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Bovine rotavirüs ve bovine coronavirüs tespiti için kullanılan primer ve problar

BRV için rRT-PCR: BRV için rRT-PCR karışımı toplamda 20 μL olacak şekilde 10 μL 2X RT-PCR Buffer, 3.5 μL nükleazdan ari su, 1 μL NVP3-F forward primer (0.5 μM), 1 μL NVP3-R reverse primer (0.5 μM), 0.7 μL Rota-Pb prob (0.1 μM) (Tablo 1), 0.8 μL RT-PCR Enzyme Mix ve 3 μL template eklenerek hazırlandı. Elde edilen rRT-PCR karışımı 45°C’de 10 dk ters transkripsiyonun ardından 95°C’de 10 dk ön denatürasyon işlemi ve akabinde 40 siklus olacak biçimde (95°C 30 sn, 55°C 30 sn, 72°C 30 sn) farklı ısılara tabi tutuldu. Son olarak 72 °C’de 5 dk süresince son uzama adımı gerçekleştirildi.

BCoV için rRT-PCR: BCoV için rRT-PCR karışımı toplamda 20 μL olacak şekilde 10 μL 2X RT-PCR Buffer, 3.5 μL nükleaz ari su, 1 μL BCoV-F forward primer (0.5 μM ), 1 μL BCoV-R reverse primer (0.5 μM), 0.7 μL BCoV-Pb prob (0.1 μM) (Tablo 1), 0.8 μL RT-PCR Enzyme Mix ve 3 μL template eklenerek hazırlandı. rRT-PCR aşamasındaki ısı döngü prosedürü BRV için uygulanan ile aynı şartlarda gerçekleştirildi.

İstatistiksel Değerlendirme: Veriler "SPSS for Windows 22.0" paket programı kullanılarak analiz edildi. Her bir parametre yüzde olarak ifade edildi ¹².

Çalışmaya dahil edilen buzağılar 1-28 günlük yaş aralığındaydı bu buzağılara ait bazı bilgiler Tablo 2’de verilmiştir. Testin sonuçlarına göre 1-7 günlük yenidoğan ishalli buzağılarda BRV nükleik asidi (%32, 8/25), 8-14 günlüklerde ise BCoV nükleik asidi (%26.31, 5/19) daha yüksek oranda tespit edildi ancak yaş grupları arasında istatistiksel fark bulunmadı (P>0.05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Real-Time PCR ile pozitif saptanan örneklerin yaş, ırk ve cinsiyete göre dağılımı

Simental (n: 36) ve montafon (n: 4) ırkı ve simental melezi (n: 19) ile montafon melezi (n: 15) hayvanların olduğu bu çalışmada, ırk bazında BRV ve BCoV’nin pozitiflik oranları değerlendirildiğinde her iki enfeksiyonun simental melezinde daha yüksek olduğu belirlendi.

40 adet dişi ve 24 adet erkek hayvandan alınan dışkı örneklerinin real-time PCR sonuçlarına göre BRV pozitiflik oranı dişilerde %27.5, erkeklerde %29.2 ve BCoV pozitiflik oranı ise dişilerde %15.0, erkeklerde %16.7 oranı ile birbirine benzer bulundu (Tablo 2).

BRV, BCoV ve miks enfeksiyon tespit edilen hayvanların ırk, yaş ve cinsiyet açısından ki-kare testi ile analizi sonucunda virüs pozitifliği ile risk faktörleri arasındaki ilişki istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (P>0.05).

Yenidoğan buzağı ishallerinin en önemli viral etkenlerinden biri olan BRV ile alakalı dünyanın farklı ülkelerinde farklı yöntemlerle birçok araştırma yapılmıştır. İshalli buzağı örneklerinde yapılan çalışmalarda İskoçya'da %35.4, İspanya'da %41.9, Fransa'nın güney batı bölgesinde %47.4, Etiyopya'da %16.7-49.3 oranında bovine rotavirüs pozitifliği tespit edilmiştir ^13-16.

Türkiye’de yenidoğan buzağı ishallerinde BRV ile ilgili yapılan çalışmalarda; 11 ilde (Ankara, Muğla, Denizli, Bursa, İzmir, Eskişehir, Muş, Samsun, Tekirdağ ve Kırklareli) %33.6 ^17, 6 ilde (Bursa, Şanlıurfa, Konya, Denizli, Samsun, Ankara) %53 ^18, Van yöresinde %17.9 ^19, Kars yöresinde %31.1 ^20, Konya ilinde yapılan 2 farklı çalışmada %18.2 ²¹ ve %8.5 ^22, Elazığ ili ve ilçelerinde %30 ^23, Siirt yöresindeki %4 (24), Tokat yöresinde %44.8 ^25, Erzurum yöresinde %6.1 ^26, Sivas ve ilçelerinde %22 ^27, Kırıkkale ve çevre illerde %37.3 ^28, Kayseri’de %56.4 ^29, Edirne ilinde %6.3 ³⁰ oranlarında BRV pozitifliği belirlenmiştir. Bu çalışmada ise BRV pozitiflik oranı ülkemizde ve dünyada yapılan çalışmalara paralel olarak %24.3 olarak saptanmıştır.

BCoV ile alakalı yapılan çalışmalarda ise İskoçya'da %3.6, İspanya'da %10.7, Fransa da %16.5, Etiyopya'da yapılan farklı araştırmalarda %21.3-38.9 oranında yenidoğan buzağı ishallerinde bovine coronavirüs pozitifliği bildirmişlerdir ^13-16.

Türkiye’nin farklı illerinde buzağılardaki ishal olgularında BCoV varlığı; 6 ilde (Bursa, Şanlıurfa, Konya, Denizli, Samsun, Ankara) %18 ^18, Van yöresinde %1.12 ^19, Kars yöresinde % 2.2 (20), Elazığ ve ilçelerinde %13 ^21, Siirt yöresinde %7 ^24, Tokat yöresinde %9.35 ^25, Erzurum ve ilçelerinde %12.1 ^26, Sivas ve ilçelerinde %9 ^27, Kırıkkale ve çevre illerde %37.27 ^28, Kayseri’de %19.2 ^29, Edirne’de %12.5 ^30, ve Marmara Bölgesinde %2 ³¹ oranında tespit edilmiştir.

Dünyada ve Türkiye’de yapılmış olan çalışmalarda ^18,23,32 BRV-BCoV ikili enfeksiyon oranları %2.43 - %13.4 arasında saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda belirlenen, ikili BRV-BCoV (%9.5) enfeksiyon oranının, Türkiye’de ve dünyada yapılmış diğer çalışmalar ile benzer olduğu görülmektedir.

Yenidoğan buzağılarda ishallerin oluşmasında yaş, ırk ve cinsiyet önemli risk faktörlerini oluşturmaktadır. Yenidoğan döneminin ilk iki haftası ishallerin oluştuğu riskli bir dönemdir. BRV için 1-7 günlük dönemde pozitiflik oranının en yüksek olduğunu belirten birçok çalışma vardır ^2,3,14,18,23. Bu çalışmada da yapılan diğer çalışmalara benzer olarak BRV en çok 1-7 gün, BCoV ise 8-15 gün yaştaki hayvanlarda saptanmıştır.

Money ve ark. ^33, erkek hayvanlarda BRV ve BCoV pozitifliğinin dişilere kıyasla daha yüksek olduğunu bildirmelerine rağmen diğer çalışmalarda ise dişi ve erkeklerdeki pozitiflik oranlarında bir fark bulamamıştır ^29,34. Çitil ve ark. ³⁵ yerel sığır ırklarındaki ishal görülme oranının (%38) simental ırklara (%29.9) kıyasla daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda da cinsiyetin yenidoğan buzağı ishallerinde önemli bir risk faktörü olmadığı, benzer şekilde simental, simental melez ve montafon melez ırklarındaki poziflik oranlarının da birbirine benzer olduğu yani ırka bağlı bir riskin bulunmadığı da belirlenmiştir.

Ülkemizde Elazığ il ve ilçelerindeki yenidoğan buzağı ishallerinde BRV ve BCoV’un araştırıldığı tek çalışma 2012 yılında Al ve Balıkçı ²³ tarafından yapılmış ve hızlı test kiti kullanılarak 30 adet yenidoğan ishalli buzağılarda %30 oranında BRV, %13 oranında BCoV ve %3.4 oranında miks enfeksiyon tespit edilmiştir. Bu çalışmada ise Elazığ ve çevre iki ilde yenidoğan buzağı ishallerindeki BRV oranı %24.3, BCoV oranı %13.5 ve miks enfeksiyon oranı %9.5 olarak belirlenmiş ve bu bölgedeki BRV ve BCoV oranının halen benzer düzeyde olduğunun göstergesi olarak değerlendirilmiştir.

Bu çalışmada, Elazığ, Malatya ve Diyarbakır illerin de BRV ve BCoV nedenli yenidoğan ishal olgularının halen önemli oranlarda görülmekte olduğu, ishale bağlı buzağı kayıplarının ve verim düşüklüğünün azaltılması için aşılama programlarının uygulanması gerekliliği sonucuna varılmıştır. Ayrıca etkin aşı suşlarının seçimi için bölgede sirküle olan BRV ve BCoV genotiplerinin belirlenmesine yönelik moleküler çalışmalara ihtiyaç olduğu düşünülmektedir.

1) Şahal M, Terzi OS, Ceylan E, Kara E. Buzağı ishalleri ve korunma yöntemleri. Lalahan Hayvancılık Araştırma Enstitüsü Dergisi 2018; 58: 41-49.

2) Dhama K, Chauhan RS, Mahendran M, Malik SVS. Rotavirus diarrhea in bovines and other domestic animals. Vet Res Commun 2009; 33: 1-23.

3) Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. Veterinary Virology. 3rd Edition, Cambridge: Academic Press, 1999.

4) Can Şahna K, Alkan F. Sığırlarda Rotavirus Enfeksiyonunun Epidemiyolojisinde Gebeliğin Rolü. FÜ Sağ Bil Vet Derg 2003; 17: 203-209.

5) Shin J, Tark D, Le VP, et al. Genetic characterization of bovine coronavirus in Vietnam. Virus Genes 2019; 55: 415-420.

6) Woo PCY, Susanna KP, Lau YH, Kwok YY. Coronavirus diversity, phylogeny and interspecies jumping. Exp Biol Med 2009; 234: 1117-1127.

7) Fung TS, Mei H, Ding XL. Coronavirus-induced ER stress response and its involvement in regulation of coronavirus-host interactions. Virus Res 2014; 194: 110-123.

8) Soltan MA, Tsai YL, Lee PA, et al. Comparison of electron microscopy, ELISA, Real Time RT-PCR and insulated isothermal RT-PCR for the detection of rotavirus group a (RVA) in feces of different animal species. J Virol Methods 2016; 235: 99-104.

9) Alkan F, Ozkul A, Bilge-Dağalp S, et al. The detection and genetic characterization based on the S1Gene region of BCoVs from respiratory and enteric infections in Turkey. Transbound Emerg Dis 2011; 58: 179-185.

10) Pang XL, Lee B, Boroumand N, et al. Increased detection of rotavirus using a real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay in stool specimens from children with diarrhea. J Med Virol 2004; 72: 496-501.

11) Decaro N, Elia G, Campolo M, et al. Detection of bovine coronavirus using a TaqMan-based real-time RT-PCR assay. J Virol Methods 2008; 151: 167-171.

12) Özdamar K. SPSS ile Biyoistatistik. 3. Baskı, Eskişehir: Kaan Kitapevi, 1999.

13) Snodgras DR, Terzolo HR, Sherwood D, et al. Aetiology of diarrhoea in young calves. Vet Rec 1986; 119: 31-34.

14) Garcia A, Ruiz JA, Orden JA, et al. Rotavirus and concurrent infections with other enteropathogens in neonatal diarrheic dairy calves in Spain. Comp Immun Microbiol Infect Dis 2000; 23: 175-183.

15) Bendali F, Bichet H, Schelcher F, Sanaa M. Pattern of diharrhoea in newborn beef calves in South-west France. Vet Res 1999; 30: 61-74.

16) Abraham G, Roeder PL, Zewdu R. Agents associated with neonatal diarrhoea in Ethiopian dairy calves. Trop Anim Heal Prod 1992; 24: 74-80.

17) Burgu İ, Akça Y, Alkan F, Özkul A, Karaoglu T. Yenidoğan ishalli buzağılarda rotavirusların electron microskopi (EM), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ve polyacrylamide gel electrophorosis (PAGE) teknikleri ile çabuk teşhisi ve antijenik karakterizasyonu. AÜ Vet Fak Derg 1995; 42: 491-498.

18) Alkan F. Buzağı ishallerinde rotavirus ve corona virusların rolü. AÜ Vet Fak Derg 1998; 45: 29-37.

19) Çabalar, M, Kaya A, Arslan, S. Yenidoğan buzağıların ishal olgularında rotavirüs ve coronavirus araştırılması. Veteriner Bilimleri Dergisi 2007; 23: 103-106.

20) Erdoğan HM, Ünver A, Güneş V, Çitil M. Frequency of rotavirus and coronavirus in neonatal calves in Kars district. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2003; 9: 65-68.

21) Ok M, Güler L, Turgut K, et al. The studies on the aetiology of diarrhoea in neonatal calves and determination of virulence gene markers of escherichia coli strains by multiplex PCR. Zoonoses Public Health 2009; 56: 94-101.

22) Duman R, Aycan AE. Prevalance of rotavirus ınfections in calves with diarrhea in Konya region. J Anim Vet Adv 2010; 9: 136-138.

23) Al M, Balıkçı E. Neonatal ishalli buzağılarda rotavirüs, coronavirüs, E.coli K99 ve cryptosporidium parvum'un hızlı test kitleri ile teşhisi ve enteropatojen ile maternal immünite ilişkisi. FÜ Sağ Bil Vet Derg 2012; 26: 73-77.

24) Kozat S, Tuncay İ. Siirt yöresindeki yenidoğan ishalli buzağılarda rotavirus, coronavirus, Cryptosporidium Spp, Escherichia coli K 99 ve Giardia lamblia etkenlerinin prevalansı. Van Veterinary Journal 2018; 29: 17-22.

25) Kaya U, Coşkun A. Tokat bölgesindeki neonatal buzağı ishallerinin etiyolojisinin belirlenmesi. Manas Journal of Agr Vet Life Sci 2018; 8: 75-80.

26) Aydın H, Timurkan MÖ. Buzağı ishallerinde coronavirusun nukleoprotein gen ve rotavirusun VP7/VP4 gen bölgelerinin kısmi sekansı ve filogenetik analizi. AÜ Vet Bil Derg 2018; 13: 211-218.

27) Küliğ C, Coşkun A. Sivas ve ilçelerindeki neonatal ishalli buzağılarda E. coli, Cryptosporidium, Clostridium perfringens, rotavirüs ve coronavirüs prevalansı. Turkish Veterinary Journal 2019; 1: 69-73.

28) Aksoy E, Kara E, Yagcı BB, Azkur AK. Investigation of Bovine Coronavirus and Bovine Rotavirus in calves with neonatal diarrhea in Kırıkkale and surrounding Provinces. Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Dergisi 2021; 9: 38-46.

29) Berber E, Çanakoğlu N, Sözdutmaz İ, et al. Seasonal and age-associated pathogen distribution in newborn calves with diarrhea admitted to ICU. Vet Sci 2021; 8: 128-135.

30) Ateş Ö, Yeşilbağ K. Neonatal buzağı ishal olgularında enterik virusların (BRV, BCoV, BVDV, BToV) çoklu enfeksiyonu J of Res in Vet Med 2022; 41: 133-142.

31) Pestil Z, Gülyaz V, Hasöksüz M. (2016). Marmara bölgesinde yeni doğan buzağı ishallerinde bovine coronavirusların saptanması ve patojenite çalışması. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi 2016; 27: 16-20.

32) Ammar MS. Prevalence of rotavirus (GARV) and coronavirus (BCoV) associated with neonatal diarrhea in calves in Western Algeria. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2014; 4: 318-322.

33) Monney JD, Adjogoua EV, Karamoko Y, Akran A. Incidences of calf diarrhea and the associated risk factors in ivory coast (2015–2017). IJAVMS 2020; 19: 454-461.

34) Uhde FL, Kaufmann T, Sager H, et al. Prevalence of four enteropathogens in the faeces of young diarrhoeic dairy calves in Switzerland. Vet Rec 2008; 163: 362-366.

35) Çitil M, Gunes V, Karademir B. 1996-2001 yılları arasında KAÜ Veteriner Fakültesi İç Hastalıkları Kliniğine getirilen ishalli buzağılar üzerine retrospektif bir çalışma. Kafkas Univ Vet Fak Derg 2003; 9: 39-42.