[ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]
Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Tıp Dergisi
2013, Cilt 27, Sayı 2, Sayfa(lar) 081-085
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
Deneysel Diyabet Oluşturulan Sıçan Böbrek Dokularındaki iNOS ve PARP İmmunreaktivitelerinin Belirlenmesi
Nevin KOCAMAN, Tuncay KULOĞLU
Fırat Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji Embriyoloji Anabilim Dalı, Elazığ, TÜRKİYE
Anahtar Kelimeler: Diyabetes mellitus, iNOS, PARP, böbrek, immünohistokimya
Özet
Amaç: Diyabetik nefropati, diabetes mellitusun önemli komplikasyonlarından biridir. Nitrik oksit (NO), diyabetteki hemodinamik değişikliklerde etkili olan çok fonksiyonlu bir mediatördür. Poli ADP riboz polimeraz (PARP) ise apoptotik süreç boyunca DNA tamirinde rol oynayan bir enzimdir. Bu enzimin proteolitik yıkımı DNA onarımını engeller ve apoptozise neden olur. Ancak aşırı aktivasyonuda apoptozis ile sonuçlanmaktadır. Bu çalışmada, Streptozotosin (STZ) ile deneysel diyabet oluşturulan sıçan böbrek dokusunda indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ve PARP immünreaktivitesinin incelenmesi amaçlanmıştır.

Gereç Yöntem: Çalışmada 14 adet erişkin Wistar Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar grup I (kontrol) ve Grup II (Diyabet) olmak üzere 2 gruba ayrıldı. Diyabet oluşturulan gruba 60 mg/kg tek doz STZ, 0.1 M Fosfat-sitrat tamponunda (pH: 4.5) çözdürülerek intraperitoneal olarak uygulandı. Tüm gruplardaki sıçanlar 10 haftalık deney sonunda anestezi altında dekapite edilip, böbrek dokuları çıkarıldı ve ışık mikroskobik inceleme için %10'luk formaldehitte tepit edildi, parafin bloklar hazırlandı. 5 μm'lik parafin kesitlerde avidin-biyotin peroksidaz metodu uygulanarak iNOS ve PARP immünreaktivitesine bakıldı. İmmünreaktivitenin şiddeti ve yaygınlığı 0'dan +3 ‘e kadar skorlanıp semi-kantitatif olarak değerlendirildi.

Bulgular: iNOS ve PARP ekspresyonlarını belirlemek için yapılan immünohistokimyasal boyamanın ışık mikroskopik incelemesinde; iNOS ve PARP immünreaktivitesi kontrol grubunda +1 yaygınlığında iken diyabetik grupta, kontrol grubuyla kıyaslandığında oldukça yoğun idi ve +3 şiddet ve yaygınlığında tesbit edildi.

Sonuç: Bu çalışma ile diyabetik grup böbrek dokularındaki hasarlanmaya, apoptozis sürecinde etkili olan iNOS ve PARP'ın önemli bir katkı sağladığı kanaatine varılmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Giriş
    Diyabet, karbonhidrat, yağ ve protein metabolizmasındaki bozukluk sonucu insülinin hedef dokularda etkisinin kaybı, insülin eksikliği yada her iki sebebin beraber etkisi sonucu meydana gelir. Son zamanlarda diyabet öncüsü olarak kabul edilen metabolik sendrom, insülin direnci ve bozulmuş açlık glukozu olarak adlandırılan klinik tabloların sanıldığından daha ciddi birer risk faktörü olduğunu göstermiştir1. Pek çok hastalık gibi diyabette de akut faz protein seviyelerinin artması, makrofajların, T lenfositlerin ve mast hücrelerinin aktiflenmesi bu hastalıkların gelişiminde özellikle inflamasyonun önemli rol oynadığını düşündürmektedir2. Diyabetin uzun dönem komplikasyonları sonucunda görme kaybı ile sonuçlanan retinopati; renal yetmezliğe gidebilen nefropati; ayak ülserleri ve amputasyonla sonuçlanan periferik nöropati; gastrointestinal, genitoüriner, kardiyovasküler semptomlara ve seksüel disfonksiyona neden olabilen otonom nöropati gelişebilmektedir3. Bu komplikasyonlar içinde diyabetin en önemli hedef organlarından biri böbreklerdir. Böbrek yetmezliği, diyabete bağlı ölüm nedenleri arasında miyokard enfarktüsünden sonra ikinci sırada bulunmaktadır4. Diyabetik nefropatinin patofizyolojisinde hipergliseminin renal hücrelerde neden olduğu oksidatif stresin artması, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekpresyonunun artması ve aşırı PARP aktivasyonu sayılabilmektedir5-6.

    Hücre içi glikoz konsantrasyonlarındaki artış, glikozun heksozamin yolağına geçmesine ve diyabetin pek çok komplikasyonunun oluşumuna neden olabilmektedir. Hiperglisemi sonucu heksozamin yolağının hız sınırlayıcı enzimi olan glutamin fruktoz-6 fosfatamidotransferaz'ın aktivitesinin artması, daha fazla fruktoz-6 fosfat üretimine yol açmaktadır6. Fruktoz-6 fosfat seviyelerinin artışı ve mitokondri iç zarında elektrokimyasal gradiyentin bozulması, hiperglisemiyle indüklenen mitokondrial superoksit yapımının artmasına ve gliser aldehit fosfat dehidrogenaz enziminin inhibisyonuna yol açar6,7. ATP sentezinin azalmasına neden olan bu durum, serbest oksijen radikallerinin oluşumunu artırır. iNOS normal şartlar altında dokularda bulunmaz ve sadece patolojik süreçlerde tespit edilebilir. Transkripsiyonel seviyede kalsiyumdan bağımsız şekilde sentez edilir. Bazı proinflamatuar uyaranlar iNOS üretimini tetikleyebilirler8. NO ile reaksiyona giren superoksit radikali, peroksinitrit (ONOO-) oluşturur. Aşırı süperoksit üretimi, endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) enziminin aktivitesini azaltıp iNOS ekspresyonunu artırır. Bu durum peroksinitrit oluşumuna sebep olur. NO'dan çok süperoksit üretimi, DNA yı tahrip eder. Hem DNA'nın harabiyeti hem de aşırı mitokondrial serbest oksijen radikali (SOR) üretimi PARP'ın aktivasyonuna yol açar. Bu durum hücre içi NAD+'nin konsantrasyonunu azaltarak glikoliz hızını, elektron transportunu ve ATP üretim hızını yavaşlatır7. Tüm bu olaylar hücreyi ölüme götüren patofizyolojik mekanizmaların başlamasına neden olur. PARP aynı zamanda Ca/Mg'ye bağlı ve DNA onarımında rol oynayan Endonükleazları da inhibe ederek hücrenin apoptoza gitmesine neden olur9. Birbiri ile bağlantılı tüm bu olaylar diyabetik komplikasyonlarının gelişiminde önemli rol oynarlar7.

    Bu çalışmada, oksidatif stres artışı ve apoptoz nedeniyle böbreklerde hasar oluşumuna neden olan diyabetin, bu süreçte rolü olan iNOS ve PARP'ın ekspresyonu üzerine etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    Bu çalışmada erişkin, Wistar Albino erkek sıçanlar kullanıldı. 21 0C oda ısısında 12 saat ışık (7:00–19:00) ve 12 saat karanlıkta (19:00–7:00) tutulan sıçanlar her gün altları temizlenen kafeslerde tutuldular. Tüm sıçanlar aynı ortamda standart sıçan yemi verilerek ad libitum olarak beslenmeye tabi tutuldular. Denekler her biri 7 sıçan içeren 2 gruba ayrıldı. Denek sayıları, litaratür bilgilerine dayanılarak ayarlandı.

    Grup I; Kontrol grubu (n=7),
    Grup II; Diyabet grubu (n=7).

    Kontrol grubuna (Grup I) deney süresince hiçbir uygulama yapılmadı. Çalışmanın başlangıcında ve sonunda düzenli bir şekilde ağırlık değişimleri ve glukoz düzeyleri kaydedildi.

    Diyabet grubuna (Grup II) 60 mg/kg Streptozotosin (Sigma Chemical Co Louis Missouri) 0.1 M Fosfat-sitrat tamponunda (pH: 4.5) çözdürülerek tek doz olarak, intraperitoneal (i.p.) yoldan uygulandı. 72 saat sonra (son 12 saat aç bırakılan), kuyruk veninden alınan kanın glukometre cihazındaki ölçümü sonucu açlık kan glukoz düzeyi 250 mg/dL'yi geçen sıçanlar diyabetik olarak kabul edildi.

    10 hafta boyunca her iki gruptaki deneklerin bakımı yapıldı ve deneyin sonunda tüm sıçanlar i.p. yolla ketamin (75 mg/kg)+xylazine (10 mg/kg) uygulanarak anestezi altında dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından sıçanların böbrek dokuları hızla çıkarılıp %10 formaldehitle tespit edildikten sonra doku takip işleminden geçirildi ve histokimyasal incelemeler için parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan 5–6 mm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Deparafinize edilen dokular dereceli alkol serilerinden geçirilip antijen geri kazanımı için sitrat tampon solüsyonunda pH:6'da mikrodalga fırında (750W) 7+5 dakika tutuldu. Zemin boyasını engellemek için Ultra V Block (TA-125-UB, LabVision Corporation, USA) solüsyonu ile muameleden sonra primerler (iNOS rabbit poliklonal NOS2 antibody SC-651 Santa Cruz Biotech, USA) (Mouse monoklonal PARP-1 antibody SC-74470 Santa Cruz Biotech, USA) ile 60 dakika inkübe edildi. Dokular, primer antikor uygulanmasından sonra sekonder antikor (30 dakika) (biotinylated Goat Anti- Poliyvalent (anti-mouse / rabbit IgG), TP–125-BN, Lab Vision Corporation, USA), Streptavidin Alkaline Phosphatase (30 dakika) (TS-060-AP, LabVision Corporation, USA) ve Fast Red Substrate System (TA-125-AF, LabVision Corporation, USA) ile inkübe edildi. Mayer's hematoksilen ile zıt boyaması yapılan dokular PBS (Phosphate Buffered Saline) ve distile sudan geçirilerek uygun kapatma solusyonu ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Olympus BX 50 ışık mikroskobunda incelenip fotoğraflandı.

    İmmünohistokimyasal boyanma değerlendirilirken intrastoplazmik boyanmanın yaygınlığı esas alındı. Boyanmanın yaygınlığı 0'dan +3'e kadar skorlanarak semikantitatif olarak değerlendirildi (Tablo 1).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: İmmünohistokimyasal boyanma yaygınlığının derecesi

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    iNOS ve PARP immünreaktivitesi için yapılan immünohistokimyasal boyamanın ışık mikroskopi altında incelenmesi sonucu; iNOS ve PARP immünreaktivitesi kontrol grubunda böbrek dokusunda sadece glomerüllerde gözlenirken proksimal, distal ve toplayıcı tübüllerde izlenmedi. Glomerüllerdeki boyamanın yaygınlığı ve şiddeti +1 olarak değerlendirildi (Şekil 1-3). Kontrol grubu ile diyabet grubu arasında iNOS ve PARP immünreaktivitesinin lokalizasyonunda bir farklılık yoktu. Ancak immünreaktivitenin yaygınlığı ve şiddeti kontrol grubu ile karşılaştırıldığında diyabet grubunda glomerüllerde +3 yaygınlığı ve şiddetinde gözlendi (Şekil 2-4).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: Kontrol grubuna ait böbrek dokusunda +1 yaygınlığında iNOS immunreaktivitesi x200


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: DM grubuna ait böbrek dokusunda +3 yaygınlığında iNOS immunreaktivitesi x200


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 3: Kontrol grubuna ait böbrek dokusunda +1 yaygınlığında PARP immunreaktivitesi X400


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 4: DM grubuna ait böbrek dokusunda +3 yaygınlığında PARP immunreaktivitesi X400

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Diabetes mellitus; hiperglisemi, dislipidemi, glikozüri ve bunlara eşlik eden bir grup metabolik bozukluğu içine alan kronik bir hastalıktır10. Makroanjiopatik ve mikroanjiopatik komplikasyonları olup mikroanjiopatik komplikasyonlar; nefropati, retinopati ve nöropati olarak gruplandırılabilir5. Diyabetik nefropati (DN); diyabetin geç bir bulgusu olmakla beraber, DN gelişmeden önce fizyolojik, patolojik ve klinik belirtiler ortaya çıkmaktadır11. Hücre içi glikoz konsantrasyonundaki aşırı artış, glikozun heksozamin yolağına geçmesine ve sonuçta diyabetin pek çok komplikasyonunun oluşmasına neden olabilmektedir6. Hiperglisemi, serbest oksijen radikallerinin oluşum hızını artırırken, koruyucu antioksidan sistemlerin kapasitesini düşürür. Bu durum diyabete bağlı komplikasyonların oluşumu üzerinde etkili olabilir12. Böbrek tubüllerinde görülen glikojen birikimleri, hücre ölümüne kadar gidebilen hasarların oluşumunda etkili olabilir13. Diabetik nefropati, böbreğin bütün bölümlerini kapsayan yapısal değisiklikleri içerir, fakat en karekteristik değişiklikler glomerüllerde saptanmıştır14. Diabetik nefropatinin erken dönemlerinde; glomerül ve tübüllerde hipertrofi, tübüler vakuolizasyon, glomerül ve tübül bazal membranlarında kalınlaşma, glomerüllerde mezangial matriks ve hücre artışı gibi histopatolojik değişikliklerin geliştiği yapılan çalışmalar ile kanıtlanmıştır15. Deneysel olarak diyabet oluşturulan sıçanlarda ve diyabet hastalarında oksijen radikallerinin ve lipid peroksidasyonunun arttığı tespit edilmiştir16. STZ enjeksiyonu ile deneysel diyabet oluşturulmuş bir çalışmada; glomeruler yumağın düzensiz bir görünüm alması, kapillerin genişlemesi, lökosit ve eritrosit birikimlerinin oluşumu gibi patolojilerin iNOS'un artması neticesinde oluştuğu sonucuna varılmıştır17.

    Hücre ile peritübülar mesafe arasında iyon taşınmasında çok fazla değişiklik olması, bazal membran genişlemelerine; hücrede enerji için gerekli olan ATP'nin azalması ise mitokondriyal bozulmalara neden olmaktadır18. Böbrek tübüllerinde, özellikle proksimal tübülde, STZ ve sitokinlerin iNOS'u artırması, böbrek dokularındaki pek çok patolojik değişikliğin NO ile ilgili olabileceğine işaret etmektedir13. Apoptozis sürecinde kaspazlar önemli bir yer tutmakta ve pek çok hücrede inaktif proenzim formunda yaygın bir şekilde bulunmaktadırlar. Ancak bir kez aktive olduklarında bir proteaz kaskadının başlamasına izin veren diğer prokaspazları aktive edebilirler. Bir kaspazın diğer kaspazı aktive edebildiği bu proteolitik kaskat, apoptotik sinyal yolaklarını uyararak hücrelerin hızlı bir şekilde ölümüne neden olur. Kaspazlar spesifik olarak, bir Asparajin rezidüsü icin mutlak gerekli substratlarında bir tetrapeptid sekansını tanır ve parçalar. Efektor kaspazlar substratların bir bölümü üzerinde etki ederek hücresel proteinlerin proteolizisine ve apoptozis aracılığı ile ölümüne neden olurlar. En iyi tanımlanmış olan kaspaz substratı, DNA onarımında rol alan bir çekirdek proteini poly-(ADP-riboz) polimeraz (PARP)'dır. PARP spesifik kaspaz parçalanması için hedeflenmiş başlangıç proteinlerinden biridir19. PARP, DNA tamirinden sorumlu nükleer enzim olup aşırı aktive olursa apoptoz ve nekroza sebep olur20. Bu mantığa dayalı olarak yapılan bir çalışmada PARP'ın inhibe edildiği farelerde, kontrol farelere göre septik şokun prognozunun daha iyi seyrettiği görülmüştür. Septik şok bakteriyel lipopolisakkaritlere bir yanıttır. Bu durumda makrofajlar aktive olur. Birçok interlökinin eksprasyonu iNOS'u aktive eder. Bu inflamasyon sonucu oluşan reaktif oksijen ürünleri DNA ile reaksiyona girer. Bunun sonucunda endotel hücrelerinin DNA sarmalları kırılır. Bu durum PARP'in aşırı aktivitesine neden olarak, geniş kanamalarla birlikte endotel hücrelerini ölüme götürür21.

    Diyabet, dokularda serbest radikalleri ve lipid peroksidasyonunu artırması nedeniyle hücrelerin apoptoza gidişini patolojik düzeyde artırmaktadır16. Yaptığımız çalışmada diyabetik böbrek hasarının oluşumu ile iNOS ve PARP ekspresyonu arasında anlamlı bir ilişki olduğu görüldü. Diyabetik böbreklerde iNOS ve PARP immunreaktivitelerinin artmasının, SOR ve apoptotik mekanizmalarla hasar oluşumuna sebep olan diyabet için beklenebilir bulgular olduğu ve litaretür bilgileri ile de tamamen uyumluluk arzettiği görüldü.

    Sonuç olarak bu çalışma ile apoptoz ve hücre sağkalımının hücresel mekanizmalarının ortaya konması ile diyabetik nefropati gibi pek çok hastalığın tedavisinde yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yönelik çalışmaların güncelleştirilebileceği kanaatine varılmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Pfister R, Cairns R, Erdmann E, Schneider CA. Prognostic impact of electrocardiographic signs in patients with Type 2 diabetes and cardiovascular disease: Results from the PROactive study. Diabet Med 2011; 28: 1206-1212.

    2) Nakbi A, Koubaa N, Ben Hamda K, et al. Association between oxidative stres parameters and inflammation markers according to the gravity of the acute coronary syndrome. Tunis Med 2011; 89: 621-626.

    3) Arslan M. Diabetes mellitusta tanı ve sınıflandırma. 2. baskı, Ankara: Öncü Basımevi, 2005: 2279-2295.

    4) Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. Temel Patoloji. 6. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, 2000: 511–517.

    5) Noh H, Ha H, Yu MR, et al. High glucose increases inducible NO production in cultured rat mesangial cells. Possible role in fibronectin production. Nephron 2002; 90: 78-85.

    6) Gürbüz E. Temel ve Klinik Endokrinoloji. 2. Baskı, İstanbul: Medikal Network, 2005: 349-373.

    7) Lester P, Enrique C. Oxidative Stres and Disease California: Taylor & Francis Group, 2008: 18-302.

    8) Parlakpınar H, Örüm MH, Acet A. Aminoguanidin ve kardiyovasküler sistem. İnönü Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi 2012; 2: 9-14.

    9) Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell 1997; 88: 355-365.

    10) Araz M. Diabetes Mellitus. 4. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, 2004: 2109-2123.

    11) Mogensen CE, Christensen CK, Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes 1983; 32: 64-78.

    12) Baydas G, Canatan H, Turkoglu A. Comparative analysis of the protective effects of melatonin and vitamin E on streptozocin-induced diabetes mellitus. J Pineal Res 2002; 32: 225-30.

    13) Dunlop M. Aldose reductase and the role of the polyol pathway in diabetic nephropathy. Kidney Int Suppl 2000; 77: 3-12.

    14) Osterby R, Asplund J, Bangstad HJ, et al. Neovascularization at the vascular pole region in diabetic glomerulopathy. Nephrol Dial Transplant 1999; 14: 348-352.

    15) Tucker BJ, Collins RC, Ziegler MG, Blantz RC. Disassociation between glomerular hyperfiltration and extracellular volume in diabetic rats. Kidney Int 1991; 39: 1176-1183.

    16) Özata M, Yörem A. Endokrinoloji Metabolizma ve Diyabet.1. Baskı, İstanbul: Medikal Yayıncılık, 2006: 275– 427.

    17) Raij L, Baylis C. Glomerular actions of nitricoxide. Kidney Int 1995; 48: 20-32.

    18) Reddy S, Kaill S, Poole CA, Ross J. Inducible nitric oxide synthase in pancreatic islets of the non-obese diabetic mouse: a light and confocal microscopical study of its ontogeny, co-localization and up-regulation following cytokine administration. Histochem J 1997; 29: 53-64.

    19) Eröz RK, Alkoç OA, Baltacı D, Oktay M, Çolakoğlu S. Apoptozis hakkında bilinenler (literatür taraması). Düzce Tıp Dergisi 2012; 14: 87-101.

    20) Roy N, Cardone MH. The caspases: consequential cleavage. Apoptosis: the molecular biology of programmed cell death. Oxford: Oxford University Press, 2002: 93-135.

    21) Gultekin N, Karaoglu K, Kucukates E. New discoveries in the mechanisms of apoptosis and cell survival and novel potential therapeutic strategies. Turk Kardiyol Dern Ars 2008; 36: 120-130.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
    [ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]