PROSTAT KANSERLİ ve BENİNG PROSTAT HİPERPLAZİLİ HASTALARDA PLAZMA VASKÜLER ENDOTELYAL BÜYÜME FAKTÖRÜ, OKSİDATİF STRES VE NİTRİK OKSİT İLİŞKİSİ

Bu çalışmada, benign prostat hiperplazili (BPH) ve prostat kanserli (PCa) hastalarda plazma vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) düzeyi ve VEGF’nin oksidatif stres ve nitrik oksit (NO) ile olan ilişkisi değerlendirilmiştir. BPH ve prostat kanseri saptanan toplam 64 hastadan venöz kan alınarak plazma VEGF, MDA ve NO düzeyleri ölçüldü. PCa’lı hastalardaki plazma VEGF seviyeleri, BPH’lı hastalardakine göre anlamlı derecede yüksekti. (61,98 ± 14,62 pq/ml ile 38,63 ± 12,74 pq/ml. p<0,05). PCa’lı hastalarda artmış plazma malondialdehit (MDA) ve artmış nitrik oksit (NO) seviyeleri tespit edildi. Sonuçlarımız, malign prostat hastalığının patogenezinde birkaç faktörün rol oynayabileceğini ve anjiojenik stimulus, oksidatif stres ve NO ekspresyonu arasında sıkı bir ilişkiyi ortaya koymuştur. İnsan prostat kanseri etyopatogenezinde ve tedavisinde anjiyogenez ve antioksidan stratejiler ile ilgili daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

In the present study, the role of plasma vascular endothelial growth factor (VEGF) and its association with oxidative stress and nitric oxide (NO) was evaluated in patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostatic carcinoma (PCa). The plasma VEGF levels in patients with prostatic carcinoma were significantly higher than in patients with BPH (61.98+14.62 pg/ml vs 38.63+ 12.74 pg/ml, p<0.05). Increased VEGF levels was detected concomitantly with increased plasma malondialdehyde (MDA) and NO levels in patients with PCa. Our results demonstrated the close relation between the angiogenic stimuli, oxidative stress and NO expression, which may be several of the contributing factors in the pathogenesis and disease status of malignant prostate. We believe that our data support further study of antiangiogenesis and antioxidant strategies for the treatment of human prostate cancer.

Giriş

Prostat kanseri (PCa), çok sık tanı konulan ve batılı ülkelerde erkek populasyonda kanserle ilişkili başta gelen ölüm sebeplerinin ikincisi olarak bildirilmiştir [1]. Prostat spesifik antijen (PSA) PCa’da en önemli ve yaygın şekilde kullanılan tümör markırı olmasına rağmen, PSA’nın benign veya malign prostat tümörlerini doğru şekilde ayırt edebilmek için sensitivite ve spesifiteye ihtiyacı vardır [2].

PCa rekürrenslerinin tespitinde veya değişik tanılarda diğer biyokimyasal markırların kullanımı için giderek artan kanıtlar vardır [2,3]. Yakın zamanda, büyüme faktörlerinin üretimindeki ve onların reseptörlerinin ekspresyonundaki anormalliklerin PCa’yı da içeren birçok solid tümörün patofizyolojisinde rol oynadığı gösterilmiştir [4,5]. VEGF potent bir anjiogenik faktördür. Değişik çalışmalarla, PCa’da mezenkimal epitelyal etkileşimlerin, tümör proliferasyonunda kritik bir rol oynayan VEGF tarafından düzenlendiği gösterilmiştir [6]. Solid tümörlerin karsinogenezisinde VEGF’nin rolünü değerlendiren çalışmalar, VEGF’nin direk anjiogenik etkilere sahip olmakla beraber, aynı zamanda NO ve serbest oksijen radikalleri gibi diğer potansiyel endojen faktörlerle kompleks ilişkilere sahip olduğunu ortaya koymuştur [7]. Bir tümörün oksijenasyon durumunun, tümör agresifliği veya metastazı ile ilişkili olduğu bildirilmiştir ve artmış seviyede reaktif oksijen türevleri ile oluşturulan bir çevrede, kanser hücrelerinin anjiogenik proteinler sekrete ederek hipoksiye adapte olduğu gösterilmiştir [8,9]. Ayrıca endotelyal hücreler için selektif olarak mitojenik olduğu bilinen VEGF’nin artışı, hem in vivo hem de in vitro olarak endotelyal hücreler tarafından NO üretimini stimüle eder [7,8].

Kanser gibi birçok hastalıkta lipid peroksidasyonunun rol oynadığı bilinmektedir. Lipid peroksidasyonunun ikinci bir ürünü olan malondialdehid (MDA) doku reaksiyon zincir hızının bir göstergesi olarak kullanılmaktadır [10]. Lipid hidroperoksitler doğrudan DNA zincirini kırabilir ve lipid peroksil ve alkoksil radikalleri DNA’da oksidasyona sebep olabilir. Böylece kanser ve yaşlanma olaylarında rol oynarlar [11]

Potent bir anjiogenik faktörün rolünü araştırmak ve onun artmış oksidatif stres ve NO ile olan ilişkisini belirlemek için, histopatolojik olarak tanı konulmuş ancak tedavi edilmemiş BPH ve PCa’lı hastalarda VEGF, MDA ve NO (nitrit+nitrat) seviyelerini karşılaştırdık.

Gereç ve Yöntem

Alt üriner sistem şikayetleri nedeniyle Fırat Tıp Merkezi Üroloji Kliniği’ne başvuran 75 erkek hasta çalışmaya dahil edildi. Tüm hastalar detaylı bir anamnez ve dijital rektal muayeneyi içeren fizik muayene ile değerlendirildi. Rutin biyokimyasal ve PSA incelemeleri tüm hastalarda yapılırken, gerekli olgularda transrektal inceleme ve/veya biyopsi uygulandı. Alt üriner sistem şikayetleri için herhangi bir tedavi uygulanan (daha önceki anti-androjen veya radyasyon terapisi, medikal veya cerrahi tedaviler gibi), üriner sistemt enfeksiyonu olan, yakın dönemde akut üriner retansiyon gelişmiş, kronik prostatit ve/veya akut inflamasyon öyküsü olan, serebrovasküler hastalığı, diabetes mellitusu, tiroid hastalığı, renal yetmezliği veya karaciğer hastalığı olan toplam 11 hasta çalışmadan çıkarıldı.

BPH (n: 38) ve PCa’lı (n: 26) hastalardan venöz kan (10 ml) alınarak, K₂EDTA içeren tüplerde saklandı. Kan örnekleri 10 dakika süreyle 8000 g devirde Hettich Universal/K2S (Almanya) marka santrifüj cihazı kullanılarak santrifüj edildi, plazması ayrıldıktan sonra analiz yapılıncaya kadar - 20 ºC’de donduruldu. VEGF, MDA ve NO’in plazma seviyeleri tüm bireylerde ölçüldü. Serum VEGF seviyesi üretici protokolüne göre uygun ticari ELISA kiti (R & D sistemleri, Minnesota, MN, USA) kullanılarak belirlendi. MDA düzeyi Ohkawa ve arkadaşlarının (12) modifiye ettiği yönteme göre saptanmıştır. Plazma NO seviyeleri ise Griess reaksiyonu kullanılarak ölçüldü (13).

Veriler SPSS 11,5 istatistik paketi kullanılarak değerlendirildi.

Bulgular

PCa’lı hastalarda yaş ortalaması 72,09 ± 7,56 (53-84 arası) iken, BPH’lı hastalarda yaş ortalaması 69,59 ± 7,62 (55-80 arası) idi (p=0,34). Prostat volümünün TRUS ile ölçümü PCa’li ve BPH’lılarda sırasıyla 70,81 ± 26,73 cm³ ve 62,48 ± 20,40 cm³’ olarak belirlendi. PCa’li ve BPH’lı hastalar arasında prostat volümü açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (p=0,27). Anormal dijital rektal muayenesi olan hastalara TRUS eşliğinde prostat biyopsisi uygulandı. 26 olguda prostat biyopsisi adenokarsinom için pozitifti. 38 hastada ise BPH saptandı.

Hastalara ait Prostat Spesifik Antijen (PSA) ve serbest PSA (f-PSA) düzeyleri Tablo 1’de verilmiştir. Prostat karsinomlu hastalarda PSA düzeyi BPH’li hasta grubuna göre daha yüksek olup bu istatiksel olarak anlamlıdır. Ancak, her ne kadar f-PSA düzeyi BPH’li hastalarda PCa’lu hastalara göre daha yüksek olsa da istatiksel olarak anlamlılık bulunamamıştır.

Plazma VEGF düzeyleri prostatik karsinomalı hastalarda BPH’lı hastalara göre anlamlı derecede yüksek saptandı. (61,98 ± 14,62 pq/ml ve 38,63 ± 12,74 pq/ml; p< 0,05) (Şekil 1). Her iki grup, plazma NO düzeyleri açısından karşılaştırıldığında PCa’lı hastalarda benzer bir artış saptandı (p< 0,05) (Şekil 2). PCa’lı hasta grubu ve BPH’li hasta grubu oksidatif stres açısından karşılaştırıldıklarında, PCa’lı hastalarda plazma MDA düzeyi istatistiksel olarak anlamlı artış gösterdi (6,18 ± 1,30 nmol/mL ile 4,78 ± 0,68 nmol/mL, p< 0,05) (Şekil-3). PCa’lı hastalarda VEGF, NO ve MDA’nın artmış düzeyleri tespit edilmiştir.

Tartışma

Büyüyen bir tümörde yer alan yeni bir mikrovasküler ağ gelişiminde anjiogenezisin, hem lokal tümör büyümesinde hem de yayılmış tümörün son halinde major bir rol oynadığı gösterilmiştir [14]. 2-3 mm³ üzerindeki solid tümör büyümesi anjiogenezise bağlıdır ve VEGF hem endotelyal hücre büyümesinin hem de permeabilitesinin potent bir indükleyicisidir [15]. VEGF önemli bir anjio-genetik faktör olarak davranır ve VEGF’nin tümör neovaskülaritesinin promotoru olduğu gösterilmiştir [16,17]. Daha önce yapılan çalışmalarda hemanjioblastomalarda, göğüs ve kolon karsinomalarında ve over kanserlerindeki stromal hücrelerde VEGF’nin immünoreaktivitesi tespit edilmiştir [18,19]. Ancak, insan prostat kanserinde VEGF’nin varlığı ve regülasyonu hakkında çok az bilgi vardır [14]. Son zamanlarda immünohistokimyasal metodların kullanıldığı bazı çalışmalarda PCa örneklerinde normal prostat ve BPH örneklerine oranla mikrovasküler dansite artışı tespit edilmiştir [4,20]. Bunun aksine, Walsh ve arkadaşları ile Jones ve arkadaşları, serum VEGF seviyelerinin benign ile malign prostatik hastalığı birbirinden ayırt etmede kullanılamayacağını bildirmişlerdir [2]. Ancak başka bir çalışmada, ortalama 20 veya 25 malign epitelyal hücrehücre içeren prostat tümörlerinde VEGF ekspresyonu gösterilmişken, BPH alanlarında VEGF ekspresyonu ya gösterilememiş ya da çok az oranda tespit edilmiştir [14]. Bu çalışmada, BPH’lı ve PCa’lı hastalarda plazma VEGF seviyelerin ölçülmüş ve PCa’lı grupta anlamlı derecede artmış plazma VEGF seviyeleri tespit edilmiştir. (p<0.05). İmmünohistokimyasal tekniklerin kullanıldığı çalışmaların çoğunda, BPH ve normal doku karşılaştırıldığında; PCa örneklerinde mikrovasküler dansitede artış olduğu, ayrıca vasküler dansitenin PCa’lı hastalarda patolojik evrenin bağımsız bir belirleyicisi olduğu gösterildiğinden, PCa’lı hastalarda artmış VEGF oranlarının olması şaşırtıcı olmaz [20,21].

Solid tümör gelişimi süresince, büyüyen lezyonlar besinleri ve uzaklaştırılan metabolik atıkları difüzyon yoluyla içeri almaya yetecek kadar küçükken, inisiyal hücreler avasküler bir ortamda klonal büyümeye uğrarlar. Ancak difüzyon lezyonun belirli bir boyutun üzerinde (~ = 2mm) büyümeye devam etmesini desteklemeye yeterli olmaz. Avasküler lezyonun progresyonu için neovaskülarite oluşturmak amacıyla anjiogenik aktiviteyi değiştirmek zorundadırlar [22]. Bundan dolayı, VEGF ve hipoksi gibi bazı anjiogenik stimuluslar hastalığın progresi süresince destek vermek zorundadır [22]. Daha önceden hipoksinin tümör agresivitesi veya metastazda bir rolü olduğu gösterilmiştir [23]. Benzer şekilde hipoksi ve artmış VEGF ekspresyonu arasında pozitif bir korelasyon da bulunmuştur [24]. Son zamanlarda, Cvetkovic ve arkadaşları insan PCa’sında anjiogenezis markırı VEGF’nin artmış ekspresyonu ile artmış hipoksi derecesi arasında anlamlı bir ilişkiyi ortaya koymuşlardır [8]. Bizim çalışmamızda da, PCa’lı hastalarda VEGF artışı ile birlikte lipid peroksidasyon ürünü olan MDA’nın da anlamlı şekilde arttığı gösterildi. Jiang ve arkadaşları doğal olarak görülen polifenolik antioksidan silymarinin anjiogenik sitokin sekresyonunu inhibe etmedeki rolünü değerlendirmişlerdir ve silymarinin kanseri önleyici kimyasal etkiye ve kritik bir destek sağlayabilecek antianjiogenik bir potansiyele sahip olduğunu göstermişlerdir [22]. Bu etkinin, kanser epitelyal hücrelerinden primer bir anjiogenik sitokin olan VEGF’nin sekresyonunun direk inhibe edilmesi yolu ile olduğu öne sürülmüştür [22] Çalışmamızda, artmış plazma MDA seviyeleri ile gösterilen artmış oksidatif stres ve artmış plazma VEGF düzeyleri ile kanser arasındaki ilişki gösterilmiştir. Bu sonuç, kontrolsüz hücresel proliferasyonun bir sonucu olarak görülen kanser epitelyal hipoksisinin VEGF ekspresyonunun potent bir in vivo indükleyicisi olduğuna dair daha önceki gözlemleri desteklemektedir [25,26].

Nitrik oksit, kanserli olgularda kompleks bir role sahip bir moleküldür. NO’nun DNA’yı hasarlayarak hastalığın başlangıcı ile ilişkili olduğu ve ayrıca immün hücrelerin tümörisidal aktivitesi için NO’nun gerekli olduğu gösterilmiştir [7,27]. VEGF’nin in vitro ve in vivo olarak endotelyal hücrelerden NO üretimini stimüle ettiği daha önceden gösterilmiştir [7]. NO ise sonradan vasküler permeabilite ve anjiogenezisi arttırır [27]. PCa’lı hastalarda BPH’lı hastalara oranla artmış VEGF seviyeleri ile ilişkili olan anlamlı derecede yüksek seviyede plazma NO düzeyleri tespit ettik.

Yakın zamanda yapılan çalışmalar göstermiştir ki, NO en az iki mekanizma ile tümör gelişimi ile ilgili olabilir. Bunlardan ilki, anjiogenezisin stimülasyonu, diğeri ise DNA üzerinde serbest radikallerin direk aktivasyonu ile artmış mutagenezisidir. [28]. Ek olarak, tümör hücrelerinden NO salınımı, NO’in antiproliferatif etkisi aracılığı ile tümör indüklü immünsupresyonda rol almasından kaynaklanabilir [29]. Sonuç olarak NO artışı, hem postat karsinomasının bir sonucu olabileceği gibi aynı zamanda prostat karsinomunun da nedeni olarak gösterilebilir.

Bizim sonuçlarımız BPH’lı hastalara kıyasla PCa’lı hastalarda plazma VEGF seviyelerinin anlamlı derecede yüksek bulunduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca anjiogenik stimulus, oksidatif stres ve NO ekspresyonu arasındaki sıkı ilişkinin, malign prostat hastalığının patogenezi ve hastalığın durumu hakkında etkili bazı faktörlerden olabileceği gösterilmiştir. Verilerimizin, insan prostat kanserinde anti-anjiogenezis ve antioksidan stratejiler ile ilgili tedavileri desteklediğine inanmaktayız.

References

1. Jackson MW, Bentel JM, Tilley WD. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. J Urol 1997; 157: 2323-2328.
2. Walsh K, Sherwood RA, Dew TK, et al. Angiogenic peptides in prostatic disease. BJU Int 1999; 84: 1081-1083.
3. Jones A, Fujiyama C, Turner K, et al. Elevated serum vascular endothelial growth factor in patients with hormone-escaped prostate cancer. BJU Int 2000; 85: 276-280.
4. Ferrer FA, Miller LJ, Andrawis RI, et al. Angiogenesis and prostate cancer: in vivo and in vitro expression of angiogenesis factors by prostate cancer cells. Urology 1998; 51: 161-167.
5. Rodeck U, Herlyn M. Growth factors in melanoma. Cancer Met Rev 1991; 10: 89-101.
6. Cunha GR. Role of mesenchymal-epithelial interactions in normal and abnormal development of the mammary gland and prostate. Cancer 1994; 74: 1030-1044.
7. Wink DA, Vodovotz Y, Laval J, et al. The multifaceted roles of nitric oxide in cancer. Carcinogenesis 1998; 19: 711-721.
8. Cvetkovic D, Movsas B, Dicker AP, et al. Increased hypoxia correlates with increased expression of the angiogenesis marker vascular endothelial growth factor in human prostate cancer. Urology 57: 821-825, 2001.
9. Yang W, de Bono DP. A new role for vascular endothelial growth factor, and fibroblast growth factors: increasing endothelial resistance to oxidative stress. FEBS Lett 1997; 403: 139-142.
10. Ueda K, Kobayashi S, Morita J, Komano T. Site-specific DNA damage caused by lipid peroxidation products. Biochim Biophys Acta 1985; 824, 341-348.
11. Oakley GG, Devanaboyina U, Robertson LW, Gupta RC. Oxidatie DNA damage induced by activation of polychlorinated biphenyls (PCBs): implications for PCB-induced oxidative stress in breast cancer. Chem Res Toxicol 1996; 9, 1285-1292.
12. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry 1979; 95: 351-358.
13. Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method. Clin Chem 1990; 36: 1440-1443.
14. Ferrer FA, Miller LJ, Andrawis RI, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human prostate cancer: In situ and in vitro expression of VEGF by human prostate cancer cells. J Urol 1997; 157: 2329-2333.
15. Folkman J. Tumor angiogenesis: Therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182-1186.
16. Dvorak HF, Brown LF, Detmer M, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, and angiogenesis. Amer J Pathol 1995; 146: 1029-1039.
17. Plate KH, Breier G, Weich HA, et al. Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature 1992; 359: 845-848.
18. Shiraishi A, Ishiwata T, Shoji T, et al. Expression of PCNA, basic fibroblast growth factor, FGF-receptor and vascular endothelial growth factor in adenomas and carcinomas of human colon. Acta Histochem Cytochem 1995; 28: 21-25.
19. Wizigmann Voos S, Breier G, Risau W, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res 1995; 55: 1358-1364.
20. Bigler SA, Deering RE, Brawer MK. Comparison of microscopic vascularity in benign and malignant prostate tissue. Human Pathol 1993; 24: 220-226.
21. Weidner N. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. Am J Pathol 1993; 143: 401-409.
22. Jiang C, Agarwal R, Lu J. Anti-angiogenic potential of a cancer chemopreventive flavonoid antioxidant, Silymarin: inhibition of key attributes of vascular endothelial cells and angiogenic cytokine secretion by cancer epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2000; 276: 371-378.
23. Hockel M, Schlenger K, Aral B, et al. Association between tumor hypoxia and malignant progression in advanced cancer of the uterine cervix. Cancer Res 1996; 56: 4509-15.
24. Shima DT, Deutsch U, D’Amore PA Hypoxic induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human epithelial cells is mediated by increases in mRNA stability. FEBS Lett 1995; 370: 203-208.
25. Damert A, Ikeda E, Risau W. Activator-protein-1 binding potentiates the hypoxia- inducible factor-1-mediated hypoxia-induced transcriptional activation of vascular-endothelial growth factor expression in C6 glioma cells. Biochem J 1997; 15: 419-423.
26. Fortsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol 1996; 16: 4604-4613.
27. Das UN. A radical approach to cancer. Med Sci Monit 2002; 8: 79-92.
28. Wamvakas S, Schmidt HHHW. Just say NO to cancer? J Natl Cancer Inst 1997; 89: 406-407.
29. Lejeune P, Lagadec P, Onier N, Pinard D, Ohshima H, Jeannin J-F. Nitric oxide involvement in tumor-induced immunosuppression. J Immunol 1994; 152: 5077-83