Çalışmaya Eylül 2017 ve Haziran 2018 tarihleri arasında Gastroenteroloji Endoskopi ünitesinde yapılan kolonoskopi bulgularına göre 10 üzeri polip saptanan ve ailesinde kolorektal karsinom öyküsü olan ve attenuated polipozis koli tanısı alanlar veya FAP nedeniyle subtotal kolektomi yapılan hastalardan kalan kolon dokusunun taraması için başvuran 30 birey dahil edildi. Çalışmaya katılan bireylerden 1 tüp (2 mL, EDTA’lı Hemogram tüpüne) kan örneği alındı ve çalışma yapılıncaya kadar –20°C´de muhafaza edildi.
DNA Eldesi: Alınan kan örneklerinden PureLink Genomik DNA Kit ile DNA yıkama, DNA binding ve DNA elüsyonu yöntemleri kullanılarak DNA izolasyonu yapıldı. İzolasyon sürecinde üreticinin tavsiye ettiği prosedürler uygulandı. İzole edilen DNA´nın saflığı, kalitesi ve konsantrasyonu NanoDrop UV spektrometre ile 230 nm, 260 nm ve 280 nm dalga boylarında ölçüm yapılarak belirlendi.
Sekans PCR Reaksiyonları: Bu çalışmada APC geninin AFP ile ilgili mutasyon ve polimorfizimleri en çok bulundurduğu belirlenen 1, 2, 3, 4, 5, 9. eksonları ve 15. eksonun 3´ son kısmında 1000 baz çiftliklik kısmı sekanslandı. 1. ekson 153 bp, 2. ekson 85 bp, 3. ekson 202 bp, 4.ekson 109 bp, 5. ekson 114 bp, 9. ekson 379 bp ve 15. ekson 1000 bp’lik 3´ son kısmı Sanger dideoksi zincir sonlanması tekniği ile sekanslandı. Bu eksonlar, uygun primerler ile amplifiye edilerek agaroz jel elektroforez tekniği uygulandıktan sonra UV ışık altında görüntülenerek doğrulandı. PCR reaksiyonu sonrası uygun amplikonların sekanları yapıldı. Sekans PCR’ında her bir eksonun amplifikasyonunda kullanılan primer çiftleri Tablo 1’de verilmiştir.
Ekson 1, Ekson 4, Ekson 5, Ekson 15A ve Ekson 15B için kullanılan PCR şartları aşağıdaki gibi optimize edilmiştir. PCR reaksiyonu, son hacim 25 μL olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. 2.5 μL 10X Taq DNA Polimeraz tamponu, 0.5 μL dNTP karışımı, 0.5 μL 10 pmol/ μL ters ve düz primerler, 0.125 μL Dream Taq DNA polimeraz, 18 μL deiyonize su ve 3 μL kalıp DNA ile PCR reaksiyonu hazırlanmıştır. Daha sonra Thermal cyclerda şu program ile amplifikasyon yapılmıştır. 94ºC de 5 dk enzim aktivasyonu yapılıp, 35 döngü olarak 94ºC 30 sn, 55 ºC 30 sn ve 72 ºC 40 sn uygulanmıştır. Son olarak 72 ºC 5 dak inkübe edilmiştir.
Ekson 2, Ekson 3, Ekson 9 için TouchDown PCR uygulanmıştır. PCR şartları aşağıdaki gibi optimize edilmiştir. PCR reaksiyonu 25 μL son hacimde gerçekleştirilmiştir. 2.5 μL 10X Taq DNA Polimeraz tamponu, 0.5 μL dNTP karışımı, 0.5 μL 10 pmol/ μL ters ve düz primerler, 0.25 μL Dream Taq DNA polimeraz, 18 μL deiyonize su ve 3 μL kalıp DNA ile PCR reaksiyonu hazırlanmıştır. Daha sonra PCR Programı (TouchDown) şu şekilde yapılmıştır. 94 ºC 2 dk, 3 döngü, 94 ºC 30 sn, 60 ºC 40 sn, 72 ºC 30 sn, 3 döngü, 94 ºC 30 sn, 58 ºC 40 sn, 72 ºC 30 sn, 25 döngü, 94 ºC 30 sn, 55 ºC 40 sn, 72 ºC 30 sn olarak uygulanmıştır.
PCR Pürüfikasyonu: PCR ile istenilen bölgelerin amplifikasyonu yapıldıktan sonra elde edilen PCR ürünleri sekan öncesi pürüfiye edilmiştir. Pürüfikasyon işlemi ExoSAP-it PCR Product Clean up kit (Thermo Fisher) ile üreticinin talimatları doğrultusunda yapılmıştır. Pürüfikasyon işlemi sonrasında saflaştırılmış PCR ürünleri Applied Biosystem ABI 3130 Sekan cihazında sekanlanmıştır. Sekans sonuçları Thermo Fisher Variant Analysis Software ile analiz edilmiştir. Referans dizi olarak APC-201 ENST00000257430.8 kullanılmıştır.