Gereç ve Yöntem: 28 adet Wistar albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar Grup 1 (Kontrol), Grup 2 (CYP), Grup 3 (RSV), Grup 4 (CYP+RSV) olarak gruplara ayrıldı. CYP 150 mg/kg/ip/tek doz, RSV 10 mg/kg/ip/7 gün uygulandı. Yedi günlük deney süresi sonunda sıçanlar sakrifiye edilerek karaciğer dokuları, histolojik ve biyokimyasal yöntemlerle incelendi. Kesitlere Hematoksilen-Eozin ve Periyodik Asit Schiff boyamaları yapıldı. Kesitler histopatolojik bulgularına göre değerlendirildi. Hasar derecesine göre 0 (yok), 1 (hafif), 2 (orta), 3 (şiddetli) olarak skorlandı. Kesitler Leica Q Win Image Analiz Sistemi ve Leica 280 ışık mikroskobu ile incelendi. Ayrıca karaciğer dokusu Malondialdehit (MDA) düzeyleri ve Katalaz (CAT) aktiviteleri spektrofotometrik yöntemlerle ölçüldü.

Bulgular: Kontrol grubuna (Grup 1) ait karaciğer dokuları normal histolojik görünümde izlendi. CYP grubunun (Grup 2) karaciğer dokularında ise portal alanda daha belirgin olmak üzere mononükleer hücre infiltrasyonu ve konjesyon, santral ven çevresinde görülen yaygın fokal nekroz alanları, hepatositlerde diffüz şişme ve sinuzoidal aralıkta daralma izlendi. PAS boyama yöntemi ile hepatositlerde glikojen kaybı ile perivasküler fibrozis tespit edildi. Grup 3 bulguları kontrol grubuna benzerdi. 4. grupta ise resveratrolün hücre infiltrasyonunu, konjesyonu, nekrozu ve sinuzoidal daralmayı anlamlı derecede iyileştirdiği gözlendi. Kontrol grubuna göre CYP grubunda karaciğer MDA düzeylerinin arttığı ve katalaz aktivitesinin azaldığı belirlendi. CYP+RSV grubunda, CYP grubuna göre karaciğer MDA düzeylerin azaldığı ve Katalaz aktivitesinin arttığı belirlendi.

Sonuç: CYP ile indüklenen sıçan karaciğer hasarında RSV’ün 10 mg/kg dozunda ve 7 gün süreyle uygulanmasında histopatolojik ve biyokimyasal olarak koruyucu etkileri olduğu gözlendi.

Kanser kemoterapisinde bir ön ilaç olan CYP, karaciğerde sitokrom P450 enzim ailesiyle metabolize edilmektedir. Metabolizasyon işleminin sonunda akrolein ve fosfamid hardalı olan sitotoksik metabolitler oluşmaktadır ³. Karaciğerde oluşan bu metabolitler sistemik dolaşımla farklı dokulara dağılarak serbest oksijen radikalleriyle (ROS) doku hasarına neden olmaktadırlar.

RSV (3, 4 ', 5 trihidrokstilben), yaralanmaya yanıt olarak bazı spermatofitler tarafından üretilen ve doğal olarak oluşan bir fitoaleksindir ⁴. Çalışmalar resveratrolün nörolojik, hepatik ve kardiyovasküler sistemler üzerindeki yararlı etkilerini göstermektedir. Resveratrol, asetaminofen, etanol ve karbon tetraklorür gibi hepatotoksinlerden kaynaklanan karaciğer hasarlarına karşı koruma sağlamaktadır ^5,6.

Bu çalışmada, antikanserojen ilaç olarak sık kullanılan CYP’nin, karaciğerde oluşturduğu yan etkilere karşı, antioksidan bir ajan olarak bilinen resveratrolün karaciğer dokusundaki etkilerinin araştırılması amaçlandı.

Hayvanlar ve Çalışma Düzeni: Çalışmada İnönü Üniversitesi Deney Hayvanları laboratuvarından temin edilen 28 adet üç aylık 250-300g ağırlıkta Wistar Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Hayvanlar deney süresince standart laboratuvar koşullarında, oda sıcaklığında barındırıldı, standart rat yemi ve musluk suyu ile ad libitum olarak beslendiler. Grup 1: Kontrol (4% etanol/ip/7gün), Grup 2: CYP (150 mg/kg/ip/tek doz), Grup 3: RSV (10 mg/kg/ip/7gün), Grup 4: CYP (150 mg/kg/ip/tek doz) + RSV (10 mg/kg/ip/7gün) olmak üzere her gruba yedi adet sıçan ayrıldı (RSV 4% etanol içinde çözdürüldü) ^5,6. Deney sırasında cerrahi bir işlem uygulanmadığı için sham grubu oluşturulmadı ve deneyin sonunda sıçanlar ketamin/ksilazin 90/10 mg/kg/ip anestezisi ile sakrifiye edilerek karaciğer dokuları çıkarıldı ⁷.

Histopatolojik Analizler: Işık mikroskobik çalışmalar için karaciğer dokuları %10'luk formalin ile fikse edildi ve doku takibine alındı. Doku takibinde Leica TP 1010 otomatik doku takip cihazı kullanıldı. Daha sonra dokular bloklara konularak parafine gömüldü. Parafin bloklardan, Leica RM 2245 (Almanya) mikrotomda 4-5 μm kalınlığında kesitler alındı. Lam üzerindeki kesitler, 1 gece etüvde bırakıldıktan sonra ışık mikroskobu incelemeleri için H-E (Hematoksilen Eosin) ve PAS (Periyodik Asit Schiff) boyamaları uygulandı. Kesitler Leica Q Win Image Analiz Sistemi ve Leica 280 ışık mikroskobu ile incelendi. Kesitlere histopatolojik hasar skorlaması yapıldı. Mononükleer hücre infiltrasyonu, konjesyon, nekroz ve sinuzoidal dilatasyon bulguları hasar olarak değerlendirildi. Hasar derecesine göre 0 (yok), 1 (hafif), 2 (orta), 3 (şiddetli) olarak skorlandı.

Biyokimyasal Analizler: Biyokimyasal analizler için alınan karaciğer dokuları çalışma gününe kadar -80ºC’de saklandı. Doku örnekleri 0,15 mol KCl solüsyonu ile 1:10 oranında homojenize edildi. Homojenatlar 3500 rpm’de 10dk santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantta MDA düzeyleri ve katalaz aktivitesi spektrofotometrik yöntemlerle belirlendi. Doku örneklerinde MDA düzeyleri, lipid peroksidasyonunun aldehit ürünlerinden olan MDA ile tiyobarbitürik asit (TBA)’in reaksiyonu temeline dayanan, Placer ve ark.’dan modifiye edilmiş olan yönteme göre ölçüldü ⁸. Doku katalaz aktivitesi ölçümü H2O2’in katalaz enzimi tarafından yıkım hızının belirlendiği Aebi metoduna göre yapıldı ⁹. CAT enzim aktivitesi, karaciğer dokularında k/g protein olarak ifade edildi. Doku protein düzeyi tayininde Lowry metodu kullanıldı ¹⁰.

İstatistiksel Analiz: Analizler için SPSS 22.0 windows versiyonu kullanıldı. Değişkenlerin normal dağılıma uygunluğu Shaphiro wilk testi ile test edildi. Normal dağılan değişkenler için dört bağımsız grup karşılaştırmasında ANOVA testi kullanıldı. Veriler aritmetik ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. P<0.05 anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Histopatolojik bulgular

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Gruplararası histopatolojik hasar skorlaması

Karaciğer MDA düzeyleri, CYP uygulanan grupta kontrol grubuna ve diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek tespit edildi (p<0.001). CYP + RSV grubunda ise CYP grubuna göre MDA düzeylerinde bir düşüş belirlendi (p<0.001). RSV grubu MDA düzeylerinin diğer gruplardan en düşük değerde olduğu bulundu. En yüksek katalaz aktivitesi kontrol grubunda tespit edildi. CYP grubu katalaz aktivitesi kontrol grubuna göre anlamlı düzeyde düşük bulundu (p<0.001). CYP + RSV grubu katalaz aktivitesi ise CYP grubuna göre yüksek ölçüldü. Karaciğer dokusu MDA düzeyleri ve CAT aktiviteleri Tablo 1’de verilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Karaciğer dokusu MDA düzeyleri ve Katalaz aktiviteleri

RSV, etanol ve karbontetraklorür (CCI4) gibi iyi bilinen hepatotoksinler için karaciğer hasarına karşı koruma sağlar ^15,16. RSV ‘ün karaciğeri koruyucu olası mekanizmaları arasında; pro-enflamatuar mediatörlerin salınımı ve sentezinin inhibibisyonuyla enflamatuvar yanıtı baskılaması, eikosanoid sentezinin modifikasyonu, kupffer hücreleri ve adezyon moleküllerinin inhibisyonu, aktive olmuş immün hücrelerin baskılanması veya indüklenebilir nitröz oksit sentaz (iNOS) ve siklooksijenaz 2 (COX-2)’nin inhibisyonu sayılabilir ¹⁷. RSV’ün birçok kanser vakasında anti-kanserojen olarak kullanıldığı da bildirilmektedir ¹⁸. Toksik maddelere maruziyet ve ilaç kullanımının yan etkilerine bağlı olarak oluşan karaciğer hasarı oldukça önemlidir. Oksidan ve antioksidan sistemler arasındaki dengenin serbest radikaller lehine bozulması olarak tanımlanan oksidatif stres, birçok patolojik durumda ortaya çıkmaktadır ¹⁹. Bu süreçte özellikle serbest oksijen radikalleri ve artmış hidrojen peroksit gibi prooksidan yapılar hasarı artırmaktadır.

Çalışmanın biyokimyasal sonuçlarına göre; sıçanlara CYP verilmesinin ardından kontrol grubuna kıyasla MDA seviyesinin arttığı, RSV verilen grupta ise MDA seviyesinin istatiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı belirlenmiştir. CYP verilen grupta, kontrol grubuna kıyasla karaciğer katalaz aktivitesinin azaldığı, sadece RSV ve CYP+RSV grupların da ise katalaz aktivitesinin arttığı gözlemlendi. Bu bulgular CYP verilmesi sonucu oluşan lipit peroksidasyonunun ve hidrojen peroksit artışının, hücresel hasara neden olduğunu ve oluşan serbest radikallerin hücresel savunmayı azalttığını göstermektedir. CYP uygulamasıyla oluşan hücresel hasarın, RSV verilen gruplarda MDA seviyesinde azalma, CAT aktivitesinde ise artma sağlaması RSV’ün iyileştirici etkisinin bir göstergesidir. Bu sonuçlar, karaciğer hasarını önleme ve düzeltme açısından güçlü antioksidan özelliklere sahip RSV ‘ün kullanılmasını destekler niteliktedir.

Çalışmanın histopatolojik bulguları RSV’ün; CYP ile indüklenen oksidatif ve enflamatuvar olaylara karşı koruyucu potansiyel sergilediğini gösterir niteliktedir. Histopatolojik çalışmalarda CYP verilen grupta karaciğer dokularındaki sinüzoidal boşlukların şiştiği ve sayıca azaldığı gözlendi. Bunun nedeni, CYP metabolitlerinin hücre zarını tahrip etmesidir ². Bu nedenle, toksisiteyi azaltabilen ve CYP’in etkili bir şekilde kullanılmasını sağlayan güçlü kemoprotektif ajanlara ihtiyaç vardır, böylece CYP tedavisi gören hastaların yaşam kalitesinde de iyileşme olacaktır.

Bu çalışmanın sonuçları; CYP uygulamasının karaciğerde oksidatif stres artışına ve doku hasarına neden olduğunu göstermektedir. CYP ile birlikte, bu dozda ve sürede RSV uygulanmasının ise karaciğer dokusunda antioksidan enzim aktivitesini artırdığı, doku hasarını azalttığı tespit edildi. Bu nedenle de RSV’ün kemoterapi ilaçlarının yan etkilerinin azaltılmasında etkili bir aday olabileceği söylenebilir. Bu iki ajanın birlikte kullanımı ile ilgili daha ileri çalışmalar yapılmasına ihtiyaç vardır.

1) Habibi E, Shokrzadeh, M Chabra. A. et. al., Protective effects of Origanum vulgare ethanol extract against cyclophosphamide-induced liver toxicity in mice. Pharm Biol 2015; 53: 10-15.

2) Nafees S, Rashid S, Ali N. et al. Rutin ameliorates cyclophosphamide induced oxidative stress and inflammation in Wistar rats: Role of NFκB/MAPK pathway. Chem Biol Interact 2015; 231: 98-107.

3) Abraham P, Sugumar E. Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: A defense mechanism? Exp Toxicol Pathol 2008; 59: 301-306.

4) Walle T. Bioavailability of resveratrol. Ann N Y Acad Sci 2011; 1215: 9-15.

5) Şener G, Toklu HZ, Şehirli AÖ. et al., Protective effects of resveratrol against acetaminophen-induced toxicity in mice. Hepatol Res 2006; 35: 62-68.

6) Chávez E, Reyes‐Gordillo K, Segoviaet J. et al., Resveratrol prevents fibrosis, NF‐κB activation and TGF‐β increases induced by chronic CCl4 treatment in rats. J Appl Toxicol 2008; 28: 35-43. 7. Rodrigues SF, Oliveira MA, Martins JO. et al., Differential effects of chloral hydrate-and ketamine/xylazine-induced anesthesia by the sc route. Life Sci 2006; 79: 1630-1637.

8) Placer ZA, Cushman LL, Johnson BC. Estimation of product of lipid peroxidation (malonyl dialdehyde) in biochemical systems. Anal Biochem 1966; 16: 359-364.

9) Aebi H. Catalase, in Methods of enzymatic analysis., Elsevier 1974; 673-684.

10) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, R. Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-275.

11) Khan TS, Sundin A, Juhlin C. et al. Vincristine, cisplatin, teniposide, and cyclophosphamide combination in the treatment of recurrent or metastatic adrenocortical cancer. Med Oncol 2004; 21: 167-177.

12) Patel J.M. Stimulation of cyclophosphamide-induced pulmonary microsomal lipid peroxidation by oxygen. Toxicology 1987; 45: 79-91.

13) Weijl N, Cleton F, Osanto S. Free radicals and antioxidants in chemotherapyinduced toxicity. Cancer Treat Rev 1997; 23: 209-240.

14) Kaplowitz, N., Biochemical and cellular mechanisms of toxic liver injury. in Semin Liver Dis, 2002. Copyright© 2002 by Thieme Medical Publishers, Inc., 333 Seventh Avenue, New

15) Ajmo JM, Liang X, Rogerss CO. Resveratrol alleviates alcoholic fatty liver in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 295: G833-G842.

16) Rivera H, Shibayama M, Tsutsumi V. et al. Resveratrol and trimethylated resveratrol protect from acute liver damage induced by CCl4 in the rat. J Appl Toxicol 2008; 28: 147-155.

17) Alarcon De La Lastra C, Villegas I. Resveratrol as an anti‐inflammatory and anti‐aging agent: Mechanisms and clinical implications. Mol Nutr Food Res 2005; 49: 405-430.

18) Zhou Y, Jin Y, Yu H. et al. Resveratrol inhibits aflatoxin B1-induced oxidative stress and apoptosis in bovine mammary epithelial cells and is involved the Nrf2 signaling pathway. Toxicon 2019; 164: 10-15.

19) Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D. et al. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress. Clin Chim Acta 2003; 329: 23-38.