Gereç ve Yöntem: Sprague-Dawley cinsi erkek sıçanlar rastgele 4 eşit gruba ayrıldı (n=7). Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmadı. AL grubuna 14 gün boyunca 30 mg/kg/gün dozunda alüminyum klorür, intraperitonal (i.p.) olarak uygulandı. AL+NAC grubuna 14 gün boyunca 30 mg/kg/gün dozunda alüminyum klorür i.p. uygulandıktan 1 saat sonra 150 mg/kg/gün N-asetilsistein 14 gün boyunca i.p. olarak uygulandı. NAC grubuna ise 150 mg/kg/gün N-asetilsistein, 14 gün boyunca i.p. uygulandı. 14. günün sonunda sıçanlar dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından kalp dokuları çıkarılarak biyokimyasal ve histolojik analizler yapıldı.

Bulgular: AL grubunda histopatolojik değişiklikler ve miyokardiyal enzim seviyelerinde artış olduğu gözlemlendi. NAC uygulamasının AL kaynaklı histopatolojik değişiklikleri azalttığı gözlemlendi. Ayrıca AL grubunda Kontrol ve NAC gruplarına kıyasla TRPM2 ve Kaspaz 3 immünreaktivitesinde anlamlı bir artış olduğu belirlendi. AL+NAC grubunda ise AL grubuna göre TRPM2 ve Kaspaz 3 immünreaktivitesinde azalma olduğu belirlendi.

Sonuç: AL kaynaklı kardiyotoksisite üzerine NAC uygulaması, biyokimyasal ve histopatolojik değişiklikleri azaltarak/hafifleterek ve TRPM2 kanalı ekspresyonunu düzenleyerek kardiyoprotektif etki gösterebilir.

N-asetilsistein (NAC) in vivo ve in vitro olarak glutatyon biyosentezini artırabilen L-Sistein için bir öncü olan güçlü antioksidan özelliğe sahip bir besin takviyesi olarak tanımlanmıştır⁹. NAC, hücre içi glutatyon seviyelerini arttırıp mitokondriyal membran depolarizasyonunu azaltarak hücrelerde apoptozu önleyebilir¹⁰. Oksidatif stresin, metal toksisitesinin ana yolu olduğu bilinmektedir¹¹. Mitokondriyal hasarın neden olduğu apoptoz, kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarının temel mekanizmalarından biridir¹². Bcl-2 ailesi, apoptozun mitokondriyal yolunda yer alır ve bir dizi süreç sonucunda Kaspaz 3'ün aktivasyonu yoluyla apoptozu indükler¹³.

Transient reseptör potansiyel melastatin 2 (TRPM2), seçici olmayan Ca2+ geçirgen bir katyon kanalıdır¹⁴. Oksidatif stres hasarı için yaygın olarak kabul edilen mekanizmalardan biride, hücre ölümünü indüklemek için hücre içi iyon homeostazının bozulmasıdır. TRPM2, vücutta geniş bir dağılıma sahiptir ve oksidatif stres ile aktivasyona karşı oldukça hassastır. Reaktif oksijen türleri (ROS) poli(ADPR)-polimeraz (PARP) ve TRPM2 kanallarının aktivasyonu, TRPM2 aracılı hücre dışı Ca2+ ve Na+ akışı, mitokondriyal Ca2+ uniporter (MCU) aracılı Ca2+ ve Na+ mitokondriyal birikiminden mitokondriyal disfonksiyona, sitokrom c salınımına ve Kaspaz 3 aktivasyonundan oluşan moleküler bir mekanizmanın aracılık ettiği kardiyomiyosit apoptozunu indükler¹⁵.

AL, kardiyovasküler sistem üzerinde toksik etkiler gösterir ancak ilgili mekanizmaları hakkında çok az çalışma vardır¹⁶. Bu çalışma, glutatyon öncüsü NAC’ın, AL’nin indüklediği kardiyotoksisiteye karşı in vivo kardioprotektif etkisini; histolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak değerlendirerek, bu etkiyi sıçan modelinde göstermek için tasarlanmıştır. Ayrıca bu sürecin TRPM2 iyon kanalları ekspresyonunu nasıl etkilediği belirlenecektir.

Deney Dizaynı: Deney hayvanlarının bakımı ile ilgili optimal koşullar (12 saat aydınlık/karanlık, 22- 25 °C sıcaklık, %50±10 nem oranı, add-libitum su ve yem) sağlandı. Deney prosedürü, Helsinki Deklarasyonuna uygun olarak gerçekleştirildi. Dicle Üniversitesi Sağlık Bilimleri Uygulama ve Araştırma Merkezi’nden temin edilen 28 adet Sprague-Dawley cinsi erkek sıçan (8-10 haftalık, 200-250 g ağırlık) rastgele eşit sayıda dört gruba ayrıldı.

Grup 1 (Kontrol) (n:7): Bu gruptaki sıçanlara herhangi bir uygulama yapılmadı.

Grup 2 (AL) (n:7): 14 gün boyunca 30 mg/kg/gün dozunda alüminyum klorür (Sigma-Aldrich, Lot: BCBC6095V), intraperitonal (i.p.) olarak uygulandı.

Grup 3 (AL+NAC) (n:7): 14 gün boyunca 30 mg/kg/gün dozunda alüminyum klorür i.p. uygulandıktan 1 saat sonra 150 mg/kg/gün N-asetilsistein (Asist® 300 mg/3 mL (%10) solüsyon içeren ampul) Hüsnü Arsan İlaçları AŞ) 14 gün boyunca i.p. uygulandı.

Grup 4 (NAC) (n:7): 14 gün boyunca 150 mg/kg/gün N-asetilsistein, i.p. uygulandı.

Deney modeli, uygulama süreleri, alüminyum klorür ve N-asetilsistein dozları yapılan çalışmalardan refere edilmiştir^17-20.

Bütün uygulamaların tamamlanmasıyla (14. gün) deney sonlandırıldı. Deneyde kullanılan sıçanlar, anestezi altında (ketamin (75 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) i.p. uygulama) intrakardiak olarak kan alındıktan sonra dekapitasyon yöntemi ile çalışma sonlandırıldı. Kalp dokuları hızlıca çıkarıldı. Alınan kan serum örnekleri çalışma gününe kadar -80 °C’de muhafaza edildi ve sadece bir defa çözüldü. Kalp dokuları histopatolojik incelemele amacıyla %10’luk formalin solüsyonuna alınarak fiksasyon işlemi yapıldı.

Biyokimyasal Analizler: Aspartat transaminaz (AST), Kreatin kinaz (CK), Kreatin kinaz izoenzimi (CKMB) ve Laktat dehidrogenaz (LDH) enzimleri ile Troponin I (TnI) düzeylerinin ölçümü, bir üniversitenin merkez laboratuvarında otomatik biyokimyasal analiz cihazı ve kitleri kullanılarak gerçekleştirildi.

Histopatolojik Değerlendirmeler: Kalp dokuları hızlıca çıkarıldıktan sonra histopatolojik değerlendirmeler için %10’luk formalin solüsyonuna alındı. Fiksasyonu sağlanan kalp dokuları rutin histolojik takip serilerinden geçirilip parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Genel histopatolojik değerlendirmeler için Hematoksilen Eozin (HE), kas lifleri arasındaki kollajen lif yoğunluğunun belirlenmesi için Masson trikrom histolojik boyama prosedürleri uygulandı. Hazırlanan preparatlar ışık mikroskobu (DM2500 LED, Leica, Almanya) ile incelendi ve fotoğraflandı (MC170 HD, Leica, Almanya). Gözlemlenen histopatolojik değişiklikler şiddetine göre; 0: yok, 1: hafif, 2: orta ve 3: şiddetli olarak değerlendirildi. Tüm grupların skorlaması yapıldıktan sonra ortalama değerler belirlendi. Masson trikrom ile boyanan preparatlarda kollajen lif yoğunluğu (fibroz); fibroz yok (0), kesit alanının %25'inden azında fibroz var^1, kesit alanının %25- 50'sinde fibroz var² ve kesit alanının %50'sinden fazlasında fibroz var³ şeklinde değerlendirildi. Tüm değerlendirmeler yapıldıktan sonra histoskor tablosu oluşturuldu.

İmmünohistokimyasal Değerlendirmeler: Kalp dokularında Kaspaz 3 ve TRPM2 immünreaktivitesinin belirlenmesi için, Avidin-Biotin-Peroksidaz Kompleks yöntemi uygulandı. Parafin bloklardan, polizinli lamlara alınan 5 μm kalınlığındaki kesitler deparafinizasyon ve şeffaflaştırma işlemlerinden sonra azalan dereceli alkol serilerinden geçirildi. Dokular mikrodalga fırında (750W), sitrat tampon solüsyonunda (pH=6.0), 7+5 dakika kaynatıldıktan sonra soğutmak için oda ısısında yaklaşık 20 dakika bekletildi. PBS (Phosphate Buffered Saline, P4417, Sigma-Aldrich, ABD) ile 3x5 dakika yıkanan dokular daha sonra endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için hidrojen peroksid blok (H2O2 blok) solüsyonu ile 5 dakika inkübe edildi (Hydrogen Peroxide Block, TA-125-HP, Lab Vision Corporation, ABD). PBS ile 3x5 dakika yıkanan dokularda zemin boyasını önlemek için 5 dakika Ultra V Block (TA–125-UB, Lab Vision Corporation, ABD) uygulandıktan sonra primer antikorlar damlatıldı. Kaspaz 3 primer antikor (PA5-16335, Thermo Scientific, ABD)/ TRPM2 primer antikor (PA2231, Boster, Pleasanton, ABD) ile 37oC sıcaklığındaki etüv içerisinde 60 dakika inkübasyona bırakıldı. PBS ile yıkanan preparatlar karanlık ve nemli ortamda oda sıcaklığında 30 dakika sekonder antikorla (TP–060-BN, Thermo Scientific, İngiltere) inkübe edildi. İnkübasyon sonrası PBS ile yıkanan dokulara Horse Radish Peroksidaz (HRP) enzimi (TS-060-HR, Thermo Scientific, İngiltere) damlatıldı ve nemli ortamda oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. Dokulara 3-Amino-9-ethyl carbazole (AEC) substrat solüsyonu (TA-060-HA, Thermo Scientific, İngiltere) uygulandı. Işık mikroskobunda kontrol edilen dokularda görüntü sinyalinin alınmasıyla reaksiyon, tüm dokularda distile su ile eş zamanlı olarak sonlandırıldı. Tüm dokulara zıt boyama olarak Harris hematoksilen yapıldı. Preparatlar distile su ile yıkandıktan sonra su bazlı kapama solüsyonu (TA-125-UG, Lab Vision Corporation, ABD) ile kapatıldı. Preparatlar, ışık mikroskobunda (DM2500 LED, Leica, Almanya) incelenip fotoğraflandı (MC170 HD, Leica, Almanya).

İmmünohistokimyasal değerlendirme; immünreaktivitenin yaygınlığı (0.1: <%25, 0.4: %26-50, 0.6: %51-75, 0.9: %76-100) ve şiddeti (0: yok, 0.5: çok az, 1: az, 2: orta, 3: şiddetli) şeklinde değerlendirildi. ‘’İmmünreaktivite = yaygınlık x şiddet’’ formulune göre hesaplanarak histoskor tablosu oluşturuldu.

İstatistiksel Analizler: Araştırma kapsamında elde edilen verilerin analizinde Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 22.0 paket programı kullanıldı. Elde edilen verilerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro Wilks testi ile kontrol edildi. Normal dağılım gösteren parametrelerin gruplar arasındaki farklarını belirlemede, Tek Yönlü Varyans Analizi (One-way ANOVA) Post-hoc Tukey çoklu karşılaştırma testi kullanıldı. Veriler, ortalama±standart sapma olarak sunuldu. Normal dağılım göstermeyen parametreler ise Kruskal-Wallis ardından Mann-Whitney U ve Bonferroni düzeltmesi kullanılarak analiz edildi. Veriler, medyan (min–maks) olarak sunuldu. İstatistiksel anlamlılık, p<0.05 olarak kabul edildi.

Güç Analizi: G*Power sürüm 3.1'de yapılmıştır (University Kiel, Almanya). Tip 1 hatası (α) 0.05 ve gücü 0.90 olan güç analizi ile her gruptaki örneklem büyüklüğü 7 sıçan olarak belirlendi^20,21.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Çalışma gruplarının biyokimyasal analiz sonuçları

Miyokard Dokusunun Histopatolojik Değerlendirmesi: AL maruziyetinin miyokardiyal morfolojik değişiklikler üzerindeki etkisi HE ve masson trikrom boyamaları ile gözlemlendi. Kontrol ve NAC gruplarında kardiyomiyositlerin sınırları belirgin, bol sitoplazmaları ile yakın düzenlenmiş ve tek tip boyama göstermiştir. Ayrıca dokularda belirgin bir inflamasyon, vasküler konjesyon, miyofibril kaybı, sitoplazmik vakuolizasyon ve kollojen lif birikimi gözlemlenmedi (Şekil 1, 2; a, d). AL grubunda kontrol grubuna kıyasla; kollajen lif birikiminin arttığı (p=.002, Şekil 1; b), yoğun vasküler konjesyon ve inflamatuar hücre artışı olduğu tespit edildi (p=.001, Şekil 2; b). Ayrıca miyofibril kaybı ve intrastoplazmik vakuolisazyon varlığı belirlendi (sırasıyla; p=.002, p=001, Şekil 2; b). AL+NAC grubunda ise AL grubu ile karşılaştırıldığında kollajen lif birikimi, vasküler konjesyon ve inflamatuar hücrelerin belirgin biçimde azaldığı tespit edildi (sırasıyla; p=.006, p=004, p=004, Şekil 1, 2; c, Tablo 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Çalışma gruplarının histopatolojik değerlendirme sonuçları

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: AL ve/veya NAC uygulamalarının kalp dokusunda kollajen lif yoğunluğu üzerindeki etkilerinin fotomikrografları: Kontrol (a), AL (b), AL+NAC (c) ve NAC (d) gruplarına ait miyokard tabakası, (ince ok); kollajen lifler. Masson trikrom, skala bar: 100μm.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: AL ve/veya NAC uygulamalarının kalp dokusu üzerindeki etkilerinin fotomikrografları: Kontrol (a) ve NAC (d) gruplarına ait miyokard tabakası. AL grubuna ait miyokard tabakası (b); vasküler konjesyon (asteriks), intrasitoplazmik vakuolizasyon (ok başı), inflamatuar hücre artışı (çentikli ok) ve miyofibril kaybı (kalın ok). AL+NAC grubuna ait miyokard tabakası (c); vasküler konjesyon (asteriks), intrasitoplazmik vakuolizasyon (ok başı), hemorajik alanlar (ince ok) ve miyofibril kaybı (kalın ok). Hematoksilen Eozin, skala bar: 100μm.

TRPM2 ve Kaspaz 3 Düzeyleri: AL maruziyetinin TRPM2 ve Kaspaz 3 seviyelerine etkisi immünohistokimyasal olarak belirlendi. İmmünreaktivite sonuçları kontrol ve NAC gruplarında benzerdi (Şekil 3, 4; a, d). AL grubunda TRPM2 immünreaktivitesinin kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde arttığı gözlemlendi (Şekil 3; b, *, p=.002). AL+NAC grubunda ise TRPM2 immünreaktivitesinin AL grubuna kıyasla önemli ölçüde azaldığı belirlendi (Şekil 3; c, #, p=.006). Benzer şekilde, AL grubu miyokardında Kaspaz 3 immünreaktivitesinin kontrol grubuna kıyasla önemli ölçüde arttığı gözlemlendi (Şekil 4; b, *, p=.001). NAC uygulamasının ise (AL+NAC grubu) AL grubuna kıyasla Kaspaz 3 immünreaktivitesini önemli ölçüde azalttığı tespit edildi (Şekil 4; c, #, p=.006).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: AL ve/veya NAC uygulamalarının kalp dokusunda TRPM2 immünreaktivitesi üzerindeki etkilerinin fotomikrografları ve immünohistoskor grafiği: Kontrol (a), AL (b), AL+NAC (c) ve NAC (d) gruplarında TRPM2 immünreaktivitesi. Kalp dokusunda TRPM2 immünohistoskor grafiği (e). Skala bar: 100μm

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: AL ve/veya NAC uygulamalarının kalp dokusunda Kaspaz 3 immünreaktivitesi üzerindeki etkilerinin fotomikrografları ve immünohistoskor grafiği: Kontrol (a), AL (b), AL+NAC (c) ve NAC (d) gruplarında Kaspaz 3 immünreaktivitesi. Kalp dokusunda Kaspaz 3 immünohistoskor grafiği (e). Skala bar: 100μm

Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, AL grubunda AST, LDH, CKMB ve TnI düzeylerinin kontrol ve NAC gruplarına kıyasla önemli ölçüde yüksek olduğunu göstermiştir. Bu verilerle tutarlı bir şekilde yakın zamanlı bir araştırma, AL maruziyetinin miyokardiyal enzim seviyelerini arttırdığını bildirilmiştir. Ayrıca aynı çalışmada bu maruziyetin miyokard tabakasında ciddi histopatolojik değişiklere sebep olduğu gösterilmiştir⁷. Bu çalışmada AL’nin miyokard tabakasında vasküler konjesyon, miyofibril kaybı, inflamatuar hücre artışı, intrastoplazmik vakuolisazyon ve kollojen lif birikimi gibi histopatolojik değişiklere sebep olduğu tespit edildi. Benzer şekilde yapılan bir başka çalışma ise AL’ye maruz kalan sıçanların kardiyomiyositlerinin, esas olarak vakuolar dejenerasyon ve miyokardiyal hipertrofi olarak ortaya çıkan patolojik hasarlar gösterdiğini ortaya koydu. Kardiyak hipertrofi, kardiyomiyositlerin işlevini azaltan Ca2+ akışının eksikliği de dahil olmak üzere, hücrelerin iyonları taşıma yeteneğini zayıflatmaktadır²⁷.

Oksidatif hasar, AL toksisitesinde hayati bir rol oynar²⁸. Ayrıca apoptozun kritik bir düzenleyici sinyali olarak kabul edilir²⁹. Oksidatif hasar Ca2+ aşırı yüklenmesine, Malondialdehit (MDA), mitokondriyal matriks ve geçirgenlik artışına, sitokrom C’nin ise salınımına yol açar. Sitoplazmadaki serbest sitokrom C, hücre içi apoptoz sinyal yolunu başlatmak için kaspazla ilgili proteinleri aktive edebilir, böylece geri dönüşümsüz kardiyomiyosit hasarına ve apoptoza neden olabilir³⁰. Kardiyomiyositlerin yenilenemez yapısı nedeniyle apoptoz, bazı kardiyak fonksiyonların kalıcı olarak kaybolmasına neden olabilir. Kaspaz ailesi, apoptoz düzenlemesindeki çekirdek proteinlerden biridir. Ortaya çıkan kanıtlar, kardiyomiyosit apoptozunda yer alan kaspaz ailesi proteinlerinin esas olarak Kaspaz 8 ve Kaspaz 3 olduğunu bulmuştur. Kaspaz 8, apoptoz yolağında Kaspaz 3'ü uyarabilen apoptotik yolun yukarısında bulunur³¹. Kaspaz ailesindeki apoptozun anahtar yürütücü molekülü olan Kaspaz 3, apoptozun erken evresinde aktive olur ve apoptozu indükler³². Bu çalışma, AL maruziyetinin sıçanların miyokardiyal dokularında proapoptotik protein olan Kaspaz 3’ün immünreaktivitesinde artış olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar Kaspaz 3’ün, AL kaynaklı kardiyomiyosit apoptozunda rol oynayabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde yapılan çalışmalar, AL maruziyetinin sıçanlarda kardiyomiyositlerin apoptozunu önemli ölçüde arttığını bildirmiştir^7,16.

Proapoptotik sitokin tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile indüklenen TRPM2 aktivasyonunun, kardiyomiyosit hücre ölümünde rol oynayabilileceği bildirilmiştir³⁰. Bunun yanı sıra mitokondri tarafından oluşturulan ve ayrıca nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oksidazların (NOX) aracılık ettiği ROS oluşumundan kaynaklanan oksidatif stres, iskemi/reperfüzyon (I/R) kaynaklı kardiyomiyosit ölümü ve miyokard hasarının başlıca nedenlerinden biridir^33,34. Genel olarak, in vitro ve in vivo çalışmalardan elde edilen bulgular, TRPM2 kanallarını, I/R hasarı ile indüklenen kardiyomiyosit ölümü ve miyokardiyal hasara aracılık eden önemli bir moleküler mekanizma olarak tanımlamaktadır¹⁵. Bunun yanı sıra, TRPM2 kanallarının kardiyomiyositlerdeki karşıt rolünü destekleyen, yani TRPM2 kanallarının ROS kaynaklı kardiyomiyosit ölümü ve miyokardiyal I/R hasarına karşı koruyucu etki göstererek kardiyak fonksiyonları düzenlediğine dair kanıtlarda bulunmaktadır^35,36. Bu çalışmada ise AL kaynaklı kardiyotoksisitede TRPM2 kanalları ekspresyonunun arttışına bağlı olarak proapoptotik protein olan Kaspaz 3 aktivasyonunun artmasının rol oynayabileceği düşünülmektedir.

Yapılan bir araştırma, NAC'ın nöron hücre ölümü, kromatoliz ve gliozis ile bağlantılı AL kaynaklı nörotoksisitede nöroprotektif etkiye sahip olduğunu ve böylece stres aracılı oksidatif doku hasarıyla mücadele etmek için endojen glutatyonu arttırdığını göstermiştir. NAC etkileşiminin nöron ortamında, astrositler ve ribozomlarla olan bu etkisi, Alzheimer hastalığı için etki mekanizması olarak kullanılabileceği bildirilmiştir¹⁰. Bu çalışmada ise AL kaynaklı kardiyotoksisite üzerine NAC uygulamasının biyokimyasal ve histopatolojik değişiklikleri azaltarak/hafifleterek kardiyoprotektif etki gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca NAC uygulamasının, TRPM2 kanalı ekspresyonu ve Kaspaz 3 immunreaktivitesindeki azaltıcı/hafifletici etkisi ile de bu süreci desteklediği düşünülmektedir.

Sonuç olarak, NAC müdahalesinin AL kaynaklı kardiyotoksik sıçan modelinde biyokimyasal histolojik ve immünohistokimyasal olarak kardioprotektif etki gösterebileceği belirlendi. Ayrıca, TRPM2 ekspresyonunun AL kaynaklı kardiyotoksisitede artış göstermesi ve NAC uygulaması ile azalması dikkat çekiciydi. TRPM2 kanalı işlev mekanizması üzerine son zamanlarda oldukça ilerleme kaydedilmiştir. Ancak TRPM2 kanalının yapısı, biyolojisi ve regülasyonu konusunda hala birçok eksik parça bulunmaktadır. Bu karmaşık katyon kanalını daha iyi anlamamıza ve TRPM2 hedefleme stratejilerinin gelişimini önemli ölçüde hızlandırmamıza yardımcı olacak daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Teşekkür: Yazar, Sayın Dr. Öğr. Üyesi Tuba YALÇIN'a çalışmaya katkılarından dolayı teşekkürlerini sunar.

1) Ali AA, Abd El-Latif DM, Gad AM, et al. Nephrotoxicity and hepatotoxicity induced by chronic aluminum exposure in rats: Impact of nutrients combination versus social isolation and protein malnutrition Arab. J Lab Med 2018; 43(2): 195-213.

2) Sanaa AA, Walaa IM. Carvedilol induces the antiapoptotic proteins Nrf2 and Bcl2 and inhibits cellular apoptosis in aluminum-induced testicular toxicity in male Wistar rats. J Biopha Biomedicine & Pharmacotherapy 2021; 139:111594

3) Balgoon MJ. Assessment of the protective effect of Lepidium sativum against aluminum-induced liver and kidney effects in albino. Rat BioMed Research International 2019; 9: 4516730.

4) González, MA, Bernal CA, Mahieu S, et al. The interactions between the chronic exposure to aluminum and liver regeneration on bile flow and organic anion transport in rats. Biological Trace Element Research 2009; 127(2): 164-176.

5) Ghorbel I, Khemakhem M, Boudawara O, et al. Effects of dietary extra virgin olive oil and its fractions on antioxidant status and DNA damage in the heart of rats co-exposed to aluminum and acrylamide. Food & Function 2015; 6(9): 3098-3108.

6) Neophytou AM, Noth EM, Liu S, et al. Ischemic heart disease incidence in relation to fine versus total particulate matter exposure in a US aluminum industry cohort. PLoS One 2016; 11(6): e0156613.

7) Galal SM, Hasan HF, Abdel-Rafei MK, et al. Synergistic effect of cranberry extract and losartan against aluminium chloride-induced hepatorenal damage associated cardiomyopathy in rats. Arch Physiol Biochem 2019; 125:4, 357-366.

8) Kumar V, Bal A, Gill KD. Aluminium-induced oxidative DNA damage recognition and cell-cycle disruption in different regions of rat brain. Toxicology 2009; 264:137-144.

9) Mokhtari V, Afsharian P, Shahhoseini M, et al. A review on various uses of N-acetyl cysteine. Cell J 2017; 19(1):11-17.

10) Elizabeth MA, Samson P, Itohan OR. Histomorphological evaluations on the frontal cortex extrapyramidal cell layer following administration of N-Acetyl cysteine in aluminum induced neurodegeneration rat model. Metab Brain Dis 2020; 35(5): 829-839.

11) Yu H, Zhang J, Ji Q, et al. Melatonin alleviates aluminium chloride-induced immunotoxicity by inhibiting oxidative stress and apoptosis associated with the activation of Nrf2 signaling pathway. Ecotoxicol Environ Saf 2019; 173: 131-141.

12) Xu J, Lin C, Wang T, et al. Ergosterol attenuates LPS-induced myocardial injury by modulating oxidative stress and apoptosis in rats. Cell Physiol Biochem 2018; 48(2): 583-592.

13) Sergio L, Thomé AMC, Trajano L, et al. Photobiomodulation prevents DNA fragmentation of alveolar epithelial cells and alters the mRNA levels of caspase 3 and Bcl-2 genes in acute lung injury. Photochem Photobiol Sci 2018; 17(7): 975-983.

14) Yu X, Xie Y, Zhang X et al. Structural and functional basis of the selectivity filter as a gate in human TRPM2 channel, Cell Reports 2021; 37(7): 110025.

15) Malko P, Jiang LH. TRPM2 channel-mediated cell death: An important mechanism linking oxidative stress-inducing pathological factors to associated pathological conditions, Redox Biology 2020; 37: 101755.

16) Zhou L, He M, Li X, et al. Molecular Mechanism of Aluminum-Induced Oxidative Damage and Apoptosis in Rat Cardiomyocytes. Biol Trace Elem Res 2021; 200: 308-317.

17) Kaya Tektemur N, Erdem Güzel E, Gül M, et al. The combination of N-acetylcysteine and cyclosporin A reduces acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. Ultrastructural Pathology 2021; 45(1): 19-27.

18) Yang X, Yuan Y, Niu Q. Effects of aluminium chloride on the methylation of app in hippocampal of rats. Journal of Hygiene Research 2016; 45(3): 345-349.

19) Ozcan Yildirim S, Colakoglu N, Ozer Kaya S. Protective effects of L‐arginine against aluminium chloride‐induced testicular damage in rats. Andrologia 2022; e14569.

20) Kaya S, Yalçın T, Boydak M, et al. Protective effect of N-acetylcysteine against aluminum-induced kidney tissue damage in rats. Biol Trace Elem Res 2022; 1-10.

21) Faul F et al. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods 2009; 41: 1149-1160.

22) Elabbassi W, Chowdhury MA, Fachtartz AAN. Severe reversible myocardial injury associated with aluminium phosphide toxicity: A case report and review of literature. J Saudi Heart Assoc 2014; 26: 216-221.

23) Sun X, Sun H, Yu K, et al. Aluminum chloride causes the dysfunction of testes through inhibiting the ATPase enzyme activities and gonadotropin receptor expression in rats. Biol Trace Elem Res 2018; 183(2): 296-304.

24) Martínez-Martínez S, Lozano-Vidal N, López-Maderuelo MD, et al. Cardiomyocyte calcineurin is required for the onset and progression of cardiac hypertrophy and fibrosis in adult mice. Febs J 2019; 286(1): 46-65.

25) Ge J, Yu H, Li J, et al. Assessment of aflatoxin B1 myocardial toxicity in rats: Mitochondrial damage and cellular apoptosis in cardiomyocytes induced by aflatoxin B1. J Int Med Res 2017; 45(3): 1015-1023.

26) Lu Y, Feng Y, Liu D, et al. Thymoquinone attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury through activation of SIRT1 signaling. Cell Physiol Biochem 2018; 47(3): 1193-1206.

27) Kumar S, Wang G, Liu W, et al. Hypoxia-induced mitogenic factor promotes cardiac hypertrophy via calcium-dependent and hypoxia-inducible factor-1α mechanisms. Hypertension 2018; 72(2): 331-342.

28) Aminjan H, Abtahi SR, Hazrati E, et al. Targeting of oxidative stress and inflammation through ROS/NF-kappaB pathway in phosphine-induced hepatotoxicity mitigation. Life Sci 2019; 232: 116607.

29) Zhang M, Zhu J, Qin X, et al. Cardioprotection of tetrahedral DNA nanostructures in myocardial ischemia-reperfusion injury. ACS Appl Mater Interfaces 2019; 11(34): 30631-30639.

30) Onaolapo AY, Ayeni OJ, Ogundeji MO, et al. Subchronic ketamine alters behaviour, metabolic indices and brain morphology in adolescent rats: involvement of oxidative stress, glutamate toxicity and caspase-3-mediated apoptosis. J Chem Neuroanat 2019; 96: 22-33.

31) Martínez MA, Ares I, Rodríguez JL, et al. Pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin induces hepatic cytochrome P450 enzymes, oxidative stress and apoptosis in rats. Sci Total Environ 2018; 631-632: 1371-1382.

32) Choudhary GS, Al-Harbi S, Almasan A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis. Methods Mol Biol 2015; 1219: 1-9.

33) Heusch G. Myocardial ischaemia-reperfusion injury and cardioprotection in perspective. Nat Rev Cardiol 2020; 10(1038): 41569.

34) Bugger H, Pfeil K. Mitochondrial ROS in myocardial ischemia reperfusion and remodeling. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Basis Dis 1866 2020; 165768.

35) Hoffman NE, Miller BA, Wang J, et al. Ca2+ entry via Trpm2 is essential for cardiac myocyte bioenergetics maintenance. J Physiol 2015; 308(6): H637-H650.

36) Miller BA, Wang J, Hirschler-Laszkiewicz I, et al. The second member of transient receptor potential-melastatin channel family protects hearts from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2013; 304(7): H1010-H1022.