Araştırma ve Yayın Etiği: Çalışma öncesinde Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’ndan 04/04/2013 tarih, 2013/03 toplantı sayılı ve 54 karar numaralı yazı ile, 05/09/2013 tarih, 2013/07 toplantı sayılı ve 104 karar numaralı yazı ile etik kurul onayı alınmıştır.
Deneysel çalışmalar, 210-280 g ağırlığında Sprague Dowley cinsi 48 adet sıçan üzerinde gerçekleştirildi. Tüm sıçanlar aynı ortamda gözetim altında tutuldu ve aynı standart sıçan yemi verilerek add-libitum su ve yiyecek alımları sağlandı. Deney hayvanları her grupta 6 hayvan olacak şekilde 8 gruba ayrıldı:
Kontrol grubu (K): Bu grupta 6 adet sıçan, deney süresi olan 21 günlük çalışmanın kontrol grubu olarak kullanıldı. Bu gruba deney süresince hiçbir uygulama yapılmadı.
Miyokard Enfarktüsü grubu (ME): Bu grupta 6 adet sıçana, 150 mg/kg isoproterenol (Isoproterenol hydrochloride, I5627, Sigma-Aldrich Corporation St. Louis, USA), 24 saat ara ile 2 kez subkutan olarak verilip, deney süresince başka hiçbir uygulama yapılmadı.
Miyokard Enfarktüsü + Zofenopril grubu (ME+Z): Bu grupta 6 adet sıçana, 150 mg/kg isoproterenol 24 saat ara ile 2 kez subkutan olarak verilip, miyokard enfarktüsü oluşturulduktan sonra deney süresi boyunca (21 gün) 15mg/kg/gün dozunda Zofenopril oral yolla verildi.
Miyokard Enfarktüsü + Nebivolol grubu (ME+N): Bu grupta 6 adet sıçana, 150 mg/kg isoproterenol 24 saat ara ile 2 kez subkutan olarak verilip, miyokard enfarktüsü oluşturulduktan sonra deney süresi boyunca (21 gün) 6 mg/kg/gün dozunda Nebivolol oral yolla verildi.
Zofenopril grubu (Z): Bu grupta 6 adet sıçana, deney süresi boyunca (21 gün) 15mg/kg/gün dozunda Zofenopril oral yolla verilip başka hiçbir uygulama yapılmadı.
Nebivolol grubu (N): Bu grupta 6 adet sıçana, deney süresi boyunca (21 gün) 6mg/kg/gün dozunda Nebivolol oral yolla verilip başka hiçbir uygulama yapılmadı.
Miyokard Enfarktüsü + Zofenopril + Nebivolol grubu (ME+Z+N): Bu grupta 6 adet sıçana, 150 mg/kg isoproterenol 24 saat ara ile 2 kez subkutan olarak verilip, miyokard enfarktüsü oluşturulduktan sonra deney süresi boyunca (21 gün) 15mg/kg/gün dozunda Zofenopril ve 6 mg/kg/gün dozunda Nebivolol oral yolla verildi.
Zofenopril + Nebivolol grubu (Z+N): Bu grupta 6 adet sıçana, deney süresi boyunca (21 gün) 15mg/kg/gün dozunda Zofenopril ve 6 mg/kg/gün dozunda Nebivolol oral yolla verilip başka hiçbir uygulama yapılmadı.
Çalışmada deneyin 2. gününde ME oluşturulan gruplara ait deney hayvanlarının kuyruk veninden alınan kan örneklerinden elde edilen serumlarda troponin I düzeylerinin kontrol grubuna göre belirgin olarak arttığı ve bu durumun miyokard enfarktüsü ile uyumlu olduğu tespit edildi.
Tüm gruplardaki sıçanlar deney sonunda ketamin (75 mg/kg) + xylazine (10mg/kg) intraperitoneal uygulanarak anestezi altında dekapite edildiler. Dekapitasyonun ardından sıçanların kalp dokuları hızla çıkarılıp histolojik çalışma için %10’luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) çalışması için çalışma gününe kadar -80°C’de saklandı.
Histokimyasal İnceleme: Her gruptan alınan kalp dokuları, %10’luk formaldehit tespit solüsyonunda 24 saat süresince tespit edildikten sonra musluk suyu altında yıkamaya alındı. Musluk suyunda 24 saat yıkanan dokular daha sonra rutin histolojik takip serilerinden geçirilip parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan alınan 5μm’lik kesitlere Masson Trikrom boyası yapıldı. Hazırlanan preparatlar Novel N-800M mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı.
İmmünohistokimyasal İnceleme: Kalp dokusunda TRPM2 immünreaktivitesinin belirlenmesi için Avidin-Biotin-Peroksidaz Kompleksi yöntemi uygulandı.
Hazırlanan preparatlar Olympus BX 50 mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı.
İmmünohistokimyasal boyanmanın değerlendirilmesinde boyanmanın yaygınlığı esas alındı. Sitoplazmik immün boyanmanın yaygınlığı 0’dan +3’e kadar sayı ile semi-kantitatif olarak skorlandı.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu Çalışması: Kalp dokularından RNA izolasyonu için PureLink™ RNA Mini kiti kullanıldı.
Spektrofotometrik RNA Ölçümü: Bu çalışmada RNA ölçümü için Qubit® RNA Assay Kit For Use With The Qubit® 2.0 Fluorometer (İnvitrogen/Molecular Probes) kullanıldı. RNA miktarı μg/mL olarak ölçüldü. cDNA sentezi için RNA miktarlarının eşitlenmesi amacıyla okunan en düşük RNA değeri standart alındı. Komplementer DNA sentezi (cDNA) için her bir gruptaki örneklerden RNA havuzu hazırlandı.
Real Time-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile cDNA Amplifikasyonu: Revers transkripsiyon ile elde edilen cDNA’lar sekans spesifik primerlerin varlığında Real Time-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PZR) ile amplifiye edildi. Gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve TRPM2 genlerinin belirlenmesi için Tablo 1’de verilen primerler kullanıldı.
Gen ekspresyon seviyeleri, Applied Biosystems 7500 Real-Time PZR sistemi ile ölçüldü. Çalışmada GAPDH kontrol gen (housekeeping) olarak kullanıldı. Isı koşulları 50°C’de 2 dakika, 95°C’de 10 dakika X 40 siklüs, 95°C’de 15 saniye ve 60°C’de 1 dakika olacak şekilde ayarlandı.
İstatistiksel Analiz: Tüm istatistiksel analizler SPSS version 21 programı kullanılarak yapıldı. Gruplar arası değerlendirme One-way ANOVA testi sonrasında Post-hoc Tukey testi ile yapılıp, grup içi değerlendirmede ise paired t-testi kullanıldı ve p<0.05 olanlar anlamlı kabul edildi.