Araştırma ve Yayın Etiği: Deney protokollerinin uygulanması için KTÜ Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulunun 10.03.2023 tarihli oturumunda 2022/55 sayılı onay alındı.
Hayvanlar: Bu çalışmada ortalama ağırlığı 250 g ve 10 haftalık toplam 14 adet yetişkin erkek Wistar albino sıçan kullanıldı. Hayvanlar KTÜ Cerrahi Araştırma Merkezi hayvan biriminden temin edildi. Sıçanlar 12:12 aydınlık-karanlık döngüsünde, kontrollü nem (%50±10) ve sıcaklık (22±1°C) ortamında barındırıldı. Yiyecek ve suya serbestçe erişmelerine izin verildi.
Elektrokortikogram (ECoG) ve Santral Enjeksiyon için Cerrahi Prosedür: Sıçanlar (her grup için n= 7), 90 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin karışımı kullanılarak intraperitonal (i.p.) enjeksiyon ile anesteziye alındı. Hayvanın başı stereotaktik aparata yerleştirildi ve kafa derisinde orta hatta sagittal bir kesi yapıldı. Bregma noktası referans alınarak lateral ventrikül koordinatları (lateral 1.40; posterior 0.8 mm) belirlendi ve kafatasına tur cihazı ile delik açıldı. Bu cerrahi prosedür, intraserebroventriküler (i.c.v.) alarin 1 nmol doz uygulaması için gerçekleştirildi. ECoG kayıtlarını elde etmek için sağ serebral korteks kraniyotomi (Harvard Instruments, South Natick, MA, ABD) ile dikkatlice açığa çıkarıldı. Kortikal yüzeyi kaplayan sıvı vazelin havuzu (37°C) oluşturuldu. Vücut ısısı homeotermik battaniye sistemi (Harvard Homeothermic Blanket, ABD) kullanılarak 37°C'de tutuldu. Olası ağrı kaynaklarını en aza indirmek için tüm temas ve insizyon noktalarına prokain hidroklorür uygulandı.
Elektrofizyolojik Kayıtlar: ECoG kayıtlarını elde etmek için Ag-AgCl top elektrot kullanıldı. Elektrotlar kayıt esnasında korteksin üzerine yerleştirdi. Elektrotların koordinatları şu şekildeydi: Birinci elektrot sagittal süturun 2 mm lateraline ve bregmanın 1 mm önüne, ikinci elektrot ise sagittal süturun 2 mm lateraline ve bregmanın 5 mm arkasına konumlandırılacak şekilde yerleştirildi. Referans elektrot sol kulak kepçesine yerleştirildi. ECoG aktiviteleri veri toplama sistemi (PowerLab 16/30; AD Instruments, Castle Hill, Avustralya) kullanılarak kaydedildi. Sinyaller BioAmp amplifikatörü (AD Instruments) kullanılarak filtrelendi (0.1-50 Hz bant aralığı). Daha sonra ECoG sinyalleri, Power Lab 4/SP kullanılarak 1024 Hz veri örnekleme hızıyla dijitalleştirildi.
Deneylerde Kullanılan Kimyasallar ve Uygulama Yöntemleri: Deneyler sırasında şu kimyasallar kullanıldı: Alarin, ketamin hidroklorür (HCl) ve ksilazin hidroklorür. Alarin, (Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Burlingame, ABD), ketamin HCl (ketalar) Pfizer'den (Pfizer, İstanbul, Türkiye) ve ksilazin HCl Bayer'den (Bayer, İstanbul, Türkiye) satın alındı. Alarin solüsyonu serum fizyolojik kullanılarak elde edildi. Alarin i.c.v yoluyla 1 nmol dozda uygulandı14.
Deney Dizaynı: Elektrofizyolojik kayıtlar 14 adet erkek sıçan kullanılarak yapıldı. Hayvanlar, her biri için yedi sıçandan oluşan 2 gruba aşağıdaki şekilde ayrıldı:
Grup I: Serum fizyolojik enjeksiyonu yapıldı.
Grup II: 1 nmol dozda i.c.v. alarin enjekte edildi.
Deneyler saat 08:00-12:00 arasında gerçekleştirildi. Tüm enjeksiyonlardan önce hayvanlardan 10 dakika süreyle bazal kayıtlar alındı. Tüm ECoG kayıtları sağ korteksten elde edildi. Her hayvandan toplamda 70 dakikalık kayıtlar alındı. Kontrol grubu için bazal kayıtlardan sonra hayvanlara i.p. serum fizyolojik enjeksiyonu yapıldı ve 60 dakika daha ECoG kayıtları alındı. Kontrol grubu alarinin çözücüsünün ECoG kayıtlarına etki edip etmediği belirlenmesi için kullanıldı ve istatistiğe dâhil edilmedi. Alarinin bazal aktiviteye olası katkısının irdelendiği grupta 10 dakikalık bazal kayıttan sonra 1 nmol dozda alarin enjekte edilerek ilave 60 dakikalık daha kayıt alındı (Şekil 1).
Veri Analizi: EEG güç spektrumu çevrimdışı olarak analiz edildi. 50 Hz filtrelemeden sonra, her 10 dakikada bir 70 dakikalık kayıtların zaman pencerelerinde Fast Fourier Transform (FFT) analizi yapıldı. Sinyaller bir Hamming penceresi ile güçlendirildi. FFT'ler, örnek büyüklüğü 1024 olan (örtüşme olmadan) güç spektrumları olarak toplandı. EEG gücü seçilen frekans bantlarında hesaplandı: Delta bandı (0.5–4 Hz), teta bandı (4–8 Hz), alfa bandı (8–13 Hz), beta bandı (13–30 Hz) ve gama bandı (30–50Hz). Belirli bir bantta yer alan tüm güç değerlerinin toplamı olan mutlak güç, beş EEG bandı için hesaplandı. Mutlak güç bir band içeriğindeki frekans değerlerinin genliklerinin karesi olarak hesaplandı (mV2/Hz). Relatif güç ise bir band içeriğindeki frekansların toplam mutlak gücünün, 0-50 Hz aralığındaki bütün frekansların toplam gücüne oranı olarak bulundu ve (%) ile ifade edildi15.
İstatistiksel Analiz: Tüm istatistiksel karşılaştırmalar GraphPad Prism 8 yazılımı kullanılarak yapıldı ve mutlak güçlerin analizi için öncelikle normallik testi Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Veriler normal dağılmadığında, ANOVA'nın tekrarlanan ölçümlerinin parametrik olmayan eşdeğeri olan Friedman testi ve ikili karşılaştırma için Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi kullanıldı. Tüm zaman noktaları bazal aktiviteyle (0-10 dakika) karşılaştırıldı. Veriler ortalama±SEM olarak sunuldu ve p<0.05 anlamlı farklılık olarak kabul edildi.