Gereç ve Yöntem: Çalışmada androjen duyarlı (LNCaP) ve androjen duyarsız (PC3) olarak iki farklı prostat kanseri hücre kültürü kullanıldı. İlk aşamada, prostat kanseri hücreleri TSC türevi ve farklı metal komplekslerinin 1, 25 ve 50 µM'lık konsantrasyonlarıyla 24 saat süreyle inkübe edildiler ve 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) yöntemi ile bu maddelerin antitümör etkinlikleri belirlendi. Comet assay ile de DNA hasarı üzerinden etkilerinin varlığı tayin edildi.

Bulgular: TSC ve metal komplekslerinin hepsinin (Ni kompleksi hariç) LNCaP hücrelerinin canlılığı üzerine doz bağımlı olarak etkilerinin olduğu belirlendi. Ancak PC3 hücreleri üzerine (ligandın 25 ve 50 µM konsantrasyonları hariç) herhangi bir etki gözlenmedi.

Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları, test edilen ajanların LNCaP hücreleri üzerine antitümör aktiviteye sahip olduğunu ve bu etkilerini androjen reseptörü varlığında DNA hasarına sebep olarak ortaya koyduğunu gösterdi.

Hücre kültürleri
Androjen reseptör pozitif (LNCaP) ve androjen reseptör negatif (PC3) insan prostat kanseri hücre serileri Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üro-onkolojik Araştırmalar Laboratuvarı'ndan ücretsiz olarak temin edildi. Tüm hücreler 25 mm² kültür flasklarında, içerisine %10 FCS, 100U/ml penisilin ve 0.1mg/ml streptomisin ilave edilerek hazırlanan RPMI-1640 medyumu ile beslendiler. %5 CO₂'li inkübatörde, 37ºC'de ve nemli ortamda tutulan hücrelerin medyumları haftada iki defa değiştirildi. Hücreler konfluent olduğunda tripsin-EDTA kullanılarak flasklardan söküldü ve 96 kuyucuklu platelere aktarılarak MTT ve Comet Assay analizlerinde kullanıldılar.

Test ajanları ile muamele
Test edilecek ajanların (L, L-Co, L-Cu, L-Ni ) 1, 25 ve 50 µM'lık konsantrasyonları ile aynı miktarlarda çözücü (DMSO) hücrelerin içinde bulunduğu kuyucuklara ilave edildi ve CO₂ inkübatöründe (Nuaire Co, Playmouth, MN, ABD) 24 saat süreyle 37ºC'de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyonlar sonrasında hücrelerin canlılık oranı bir hemositometrede %0.4 tryphan blue kullanılarak belirlendi. Canlılık oranının %90'ın altında olduğu durumlarda deneylere başlanmadı.

MTT Assay
Sitotoksik etkiler, sitotoksisitenin değerlen-dirilmesinde yaygın olarak kullanılan enzimatik test yöntemlerinden biri olan MTT [3-(4,5-dimetiltiazol–2-il)-difenil tetrazolium bromid] assay yöntemi ile belirlendi²⁷. Bu yöntem, MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmakladır. Bu yöntemde, MTT canlı hücrelere aktif olarak absorbe olur ve reaksiyon mitokondriyal süksinat dehidrogenaz tarafından katalize edilerek mavi-mor renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenir. Formazan oluşumu, yalnızca aktif mitokondrinin bulunduğu canlı hücrelerde görülmektedir. Bu da hücre canlılığının bir belirteci olarak kabul edilmekte ve spektrofotometrik olarak belirlenen değer yasayan hücre sayısı ile ilişkilendirilmektedir^27,28. Steril PBS içerisinde hazırlanan stok MTT solüsyonundan, 0,5 mg/mL MTT çalışma solüsyonu hazırlandı ve 96 kuyucuklu plaklara ilave edildi. İnkübatörde 3 saat bekletildikten sonra plakalardaki hücrelerin optik dansiteleri ELISA cihazında (Bio-Rad, ABD) 540 nm dalga boyunda okutuldu²⁹. Kontrol kuyucukları okutularak elde edilen absorbans değerlerinin ortalaması alındı ve bu değer %100 canlı hücre olarak kabul edildi. Çözücü ve ajan uygulanan kuyucuklardan elde edilen absorbans değerleri kontrol absorbans değerine oranlandı ve yüzde canlılık olarak kabul edildi. MTT denemeleri farklı günlerde en az 10 kez tekrarlandı ve test maddelerinin prostat kanseri hücreleri üzerine sitotoksik etkilerinin olup olmadığı tespit edilmeye çalışıldı.

Comet Assay
Tek hücre jel elektroforezi olarak da bilinen Comet Assay, memelilerin DNA hasarını (genotoksisite) belirlemek için yaygın olarak kullanılır³⁰. Nötral comet assay tekniği Devlin ve ark.³¹ tarafından tarif edilen metotta küçük değişiklikler yapılarak uygulandı. Kısaca şöyleydi: İlk olarak rodajlı lamlar mikrodalga fırında PBS içerisinde çözdürülen %0.65'lik high melting agarose (HMA) ile kaplandı ve karanlıkta 1 gün süreyle kurumaya bırakıldı. Kültüre edilen prostat kanser hücre tipleri, test edilecek bileşiklerin farklı konsantrasyonları (1, 25 ve 50 µM) ile 24 saat inkübe edildiler. İnkübasyondan sonra hücreler 42ºC sıcaklıktaki low melting agarose ile karıştırılarak HMA ile kaplanmış lam üzerine yayıldı ve lamların üzeri hızlı bir şekilde lamelle kapatılarak agar katılaşıncaya kadar 10-15 dakika süreyle karanlıkta +4ºC'de tutuldular. Daha sonra lamlar stok lizis solüsyonundan (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, pH: 10) taze olarak hazırlanmış soğuk lizis solüsyonu (stok lizis solüsyonuna, %1 Triton X-100 ve %10 DMSO ilave edilerek hazırlandı) içerisine yerleştirildi ve yine karanlıkta +4ºC'de 1 saat süreyle bekletildi.

Elektroforez
Lizis işleminden sonra lamlar içerisi soğuk nötral elektroforez tamponu ile dolu yatay bir elektroforez tankına (Bio-Rad, ABD) aynı yönlü olarak yerleştirildi. Lamlar tanka yerleştirilmeden önce tankın voltu 25 V (0.83 V/cm), amperi de 300 mA'e sabitlendi ve 20 dakika süreyle işleme devam edildi. Elektroforez sonrasında lamlar nötralizasyon tamponu (0.4 M Tris, pH 7.5) ile 3 kez 5 dk, +4ºC'de nötralize edildiler. Daha sonra lamlar, 50 µl ethidium bromide ile boyandı ve üzerine lamel kapatılarak karanlıkta +4ºC'de 20-30 dk. kadar bekletildi.

Skorlama
Skorlama işlemi, bir floresans mikroskop (Zeiss Axiovert, Almanya) ve Comet IV software programı kullanılarak yapıldı. Her lamdan rastgele en az 25 hücre sayılarak, grupların tail intensity (TI), tail lenght (TL) ve tail moment (TM) parametreleri belirlendi. TI, TL ve TM parametrelerinde meydana gelen artışlar DNA hasarının varlığını ve oranını belirlememize yardımcı oldu. Analizler farklı günlerde en az beşer kez tekrarlandı.

İstatistiksel Analizler
Verilerin analizinde SPSS 15.0 for Windows programı kullanıldı. MTT Assay'den elde edilen hücre canlılığı yüzde değerleri Students' t testi kullanılarak, Comet Assay'den elde edilen sonuçlar da one-way ANOVA post hoc Tukey HSD testi kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar ortalama±SEM olarak belirtildi ve p<0.05 olanlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: LNCaP ve PC3 insan prostat kanser hücre kültürlerine test ajanlarının uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (Students' t testi; ap<0.001, bp<0.005, cp<0.01 ve dp<0.05).

LNCaP hücrelerine uygulanan ligandın 25 ve 50 µM konsantrasyonları hücre canlılığında anlamlı azalmaya sebep olurken (p<0.01 ve p<0.005, sırasıyla; Şekil 1A), PC3 hücreleri üzerine sitotoksik etki sadece ligandın en yüksek konsantrasyonda gözlendi (p<0.05, Şekil 1B). L-Cu'nun test edilen tüm konsantrasyonları LNCaP hücrelerinin canlılığında anlamlı azalmalara sebep oldu (1 µM için p<0.005; 25 ve 50 µM için p<0.001; Şekil 2) ancak PC3 hücreleri üzerine herhangi bir sitotoksik etki oluşturmadı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: LNCaP (A) ve PC3 (B) hücre kültürlerine ligand uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (Students' t testi; bp<0.005, cp<0.01 ve dp<0.05).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: LNCaP hücre kültürlerine ligand-Cu kompleksinin uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (Students' t testi; ap<0.001, bp<0.005).

L-Co'nun 1, 25 ve 50 µM'lık konsantrasyonlarının hiçbiri PC3 hücrelerinin canlılık oranlarında anlamlı bir anlamla azalma meydana getirmezken, LNCaP hücrelerinin canlılık oranları uygulanan tüm konsantrasyonlarda anlamlı şekilde azaldı (p<0.005; Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: LNCaP hücre kültürlerine ligand-Co kompleksinin uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (Students' t testi; bp<0.005).

LNCaP hücreleri üzerine uygulanan L-Ni konsantrasyonlarının tamamı anlamlı biçimde sitotoksik etki sergilerken (1 ve 25 µM için p<0.005; 50 µM için p<0.01; Şekil 4), test edilen bileşiklerin hiçbir konsantrasyonu PC3 hücrelerinin canlılığının anlamlı biçimde azalmasına neden olmadı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: LNCaP hücre kültürlerine ligand-Ni kompleksinin uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (Students' t testi; bp<0.005, cp<0.01).

DNA hasarı Comet Assay yöntemi kullanılarak belirlendi. LNCaP ve PC3 hücreleri sentezlenen ligand ve liganda bağlı Cu, Co ve Ni gibi metal komplekslerinin 1 ve 50 µM'lık iki farklı konsantrasyonuyla 24 saat süreyle inkübe edildiler. Elde edilen TI, TL ve TM parametreleri Tablo 2 (PC3) ve Tablo 3'te (LNCaP) sunulmuştur. Test edilen maddelerin düşük veya yüksek konsantrasyonlarının hiç biri PC3 hücrelerinin DNA'sında anlamlı herhangi bir hasara sebep olmadı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: PC3 insan prostat kanser hücre kültürlerine test ajanlarının uygulanmasından 24 saat sonra TI, TL ve TM değerlerinde meydana gelen değişiklikler (one-way ANOVA, post hoc Tukey HSD testi).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 3: LNCaP insan prostat kanser hücre kültürlerine test ajanlarının uygulanmasından 24 saat sonra TI, TL ve TM değerlerinde meydana gelen değişiklikler (one-way ANOVA, post hoc Tukey HSD testi; ap<0.001, bp<0.05 ve cp<0.005).

Ligandın uygulanan düşük ve yüksek konsantrasyonlarının her ikisi de TI (p<0.001), TL (p<0.001; p<0.005, sırasıyla) ve TM (p<0.001; p<0.005, sırasıyla) parametrelerini istatistiksel olarak anlamlı şekilde artırdı. 24 saat süreyle 1 µM L-Cu uygulaması parametrelerin herhangi birinde artış meydana getirmezken, 50µM'lık konsantrasyon her üç parametreyi de (TI, TL ve TM) artırarak doz bağımlı bir şekilde DNA hasarına sebep oldu (p<0.001; Tablo 3). L-Co ve L-Ni uygulaması da L-Cu uygulaması ile benzer şekilde DNA hasarını doz bağımlı olarak artırdı (her iki kompleks için p<0.001; Tablo 3).

Teşekkür
Bu proje İnönü Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (BAPB Proje No: 2010/49) tarafından desteklenmiştir. Prostat kanseri hücrelerini temin etmemizde yardımlarını esirgemeyen Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Prof. Dr. Levent Türkeri'ye teşekkür ederiz.

1) Sağlık Bakanlığı Kanserle Savaş Dairesi Başkanlığı. “2005 Yılı Türkiye Kanser İstatistikleri“ www.saglik.gov.tr/TR/dosya/1-44481/h/kanser-istatistikleri.xls 18.02.2011.

2) Greenlee RT, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin 2000; 50: 7-33.

3) Liberta AE, West DX. Antifungal and Antitumour Activity of Heterocyclic Thiosemicarbazones and Their Metal Complexes. Biometals 1992; 5: 121-126, (1992).

4) Demertzi DK, Domopoulou A, Demertzis MA, et al. Palladium (II) Complexes of 2-Acetylpyridine N(4)-Methyl, N(4)-Ethyl and N(4)-Phenyl - Thiosemicarbazones. Crystal Structure of Chloro (2-Acetylpyridine N(4)-Methylthiosemicarbazonato) Palladium (II). Synthesis, Spectral Studies, In Vitro and In Vivo Antitumour Activity. J of Inorg. Biochem 1997; 68: 147-155.

5) Offing OE, Martelli S. Antibacterial Activity of Metal Complexes of Benzil and Benzoin Thiosemicarbazones. IL Farmaco 1994; 49: 513-518.

6) Barton JK, Lippard SJ. Nucleic Acid Metal Ion Interactions, Sparo, T.G., Ed., Wiley Interscience, New York, 1980: pp:31-113.

7) Ferrari BM, Capacchi S, Pelosi G, et al. Synthesis, Structural Characterization and Biological Activity of Helicin Thiosemicarbazone Monohydrate and a Copper (II) Complex of Salicylaldehyde Thiosemicarbazone. Inorganica Chimica Acta 1999; 286: 134-141.

8) Alvero AB, Chen W, Sartorelli AC, et al. Triapine (3-amino-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone) Induces Apoptosis in Ovarian Cancer Cells. J Soc Gynecol Investig 2006; 13:145–152.

9) Yu Y, Wong J, Lovejoy DB, et al. Chelators at the cancer coalface: desferrioxamine to Triapine and beyond. Clin Cancer Res; 2006; 12: 6876–6883.

10) Cory JG, Cory AH, Rappa G, et al. Inhibitors of ribonucleotide reductase. Comparative eVects of amino- and hydroxy-substituted pyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazones. Biochem Pharmacol; 1994; 48: 335–344.

11) Finch RA, Liu M, Grill SP, Rose WC, Loomis et al. Triapine (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde-thiosemicarbazone): a potent inhibitor of ribonucleotide reductase activity with broad spectrum antitumor activity. Biochem Pharmacol; 2000; 59: 983–991.

12) Feun L, Modiano M, Lee K, et al. Phase I and pharmacokinetic study of 3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone (3-AP) using a single intravenous dose schedule. Cancer Chemother Pharmacol; 2002; 50: 223–229.

13) Kishore Kumar GD, Chavarria GE, Charlton-Sevcik AK, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of potent thiosemicarbazone based cathepsin L inhibitors. Bioorg Med Chem Lett; 2010;20: 1415-9.

14) Adsule S, Barve V, Chen D, et al. Novel Schiff base copper complexes of quinoline-2 carboxaldehyde as proteasome inhibitors in human prostate cancer cells. J Med Chem; 2006; 49: 7242-7246.

15) Sonmez M, Levent A, Sekerci M. Synthesis and characterization of Cu(II), Co(II), Ni(II), and Zn(II) complexes of a Schiff base derived from 1-amino-5-benzoyl-4-phenyl-1H-pyrimidine-2-one and 3-hydroxysalicylaldehyde. Synt. and React. Inorg and Metal-Org. Chem 2003; 33: 1747-1761.

16) Balaban A, Sekerci M, Erk B. Synthesis, physico-chemical characterization, and stability constants of metal complexes of pyridine-2-carbaldehyde thiosemicarbazone. Synt. and React. Inorg and Metal-Org. Chem 2003; 33: 1775-1786.

17) Sonmez M, Sekerci M. Synthesis and characterization of Cu(II), Co(II), Ni(II) and Zn(11) Schiff base complexes from 1-amino-5-benzoyl-4-phenyl-1H-pyrimidine-2-one with salicylaldehyde. Polısh J. Chem 2002; 76: 907-914.

18) Temel H, Taskin T, Sekerci M. Spectral and antifungal studies of transition metal complexes of N,N '-ethylenebis(salicylideneimine). Russıan J Inorg Chem 2004; 49: 347-351.

19) Sonmez M, Sekerci M. A new heterocyclic Schiff base and its metal complexes. Synt and React Inorg and Metal-Org Chem. 2004; 34: 489-502.

20) Sonmez M, Sekerci M. Synthesis, characterization, and thermal investigation of copper(II), nickel(II), cobalt(II), and zinc(II) complexes with 5-benzoyl-1-(phenylmethylenamino)-4-phenyl-1H-pyrimidine-2-thione. Synt and React Inorg and Metal-Org Chem. 2003; 33: 1689-1700.

21) Temel H, Cakir U, Ugras HI, Sekerci M. The synthesis, characterization and conductance studies of new Cu(II), Ni(II) and Zn(II) complexes with the Schiff base derived from 1,2-bis-(o-aminophenoxy)ethane and salicylaldehyde. J Coordination Chemıstry 2003; 56: 943-951.

22) Temel H, Ilhan S, Sekerci M. Synthesis and characterization of a new bidentate Schiff base and its transition metal complexe. Synt and React Inorg and Metal-Org Chem 2002; 32: 1625-1634.

23) Temel H, Ilhan S, Sekerci M, Ziyadanogullari R. The synthesis and spectral characterization of new Cu(II), Ni(II), Co(III), and Zn(II) complexes with Schiff base. Spectroscopy Letters 2002; 35: 219-228.

24) Boybay M, Sekerci M. Synthesis and characterization of 1,2-benzylidenedioxy-7-(2-hydroxybenzylideneamino)-4-azaheptane and its complexes with transition metals. Russıan J General Chemıstry 2002; 72: 1266-1270.

25) Sekerci M, Alkan C. Cukurovali A. Synthesis and metal complexation of a Schiff base derivative of 2-amino-4-(p-tolyl)thiazole. Russıan J Inorganıc Chemıstry 2000; 45: 1229-1233.

26) Temel H, Sekerci M. Novel complexes of manganese(III), cobalt(II), copper(II), and zinc(II) with Schiff base derived from 1,2-bis(p-aminophenoxy)ethane and salicylaldehyde. Synt and React Inorg and Metal-Org Chem 2001; 31: 849-857.

27) Denizot F, Lang R. Rapid colorimetrik assay for cell growth and survival modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods 1986; 89: 271–277.

28) Horakova K, Sovcikova A, Seemannova Z, et al. Detection of drug-induced, superoxide-mediated cell damage and its prevention by antioxidants. Free Radic Biol Med 2001; 30: 650–664.

29) Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Meth 1983; 65: 55-63.

30) Klaude M, Eriksson S, Nygren J, Ahnstrom G. The comet assay: mechanisms and technical considerations. Mutat Res 1996; 12: 89-96.

31) Devlin HL, Mack PC, Burich RA, et al. Impairment of the DNA repair and growth arrest pathways by p53R2 silencing enhances DNA damage-induced apoptosis in a p53-dependent manner in prostate cancer cells. Mol Cancer Res. 2008; 6: 808-18.

32) Subbagh HE, Obaid AA. 2,4-Disubstituted Thiazoles II. A Nevel Class of Antitumour Agents, Synthesis and Biological Evaluation. Eur J Med Chem 1996; 31: 1017-21.

33) Garcia-Tojal J, Garcia-Orad A, Diaz AA, et al. Biological activity of complexes derived from pyridine-2-carbaldehyde thiosemicarbazone. J Inorg Biochem 2001; 84: 271-278.

34) Sartorelli AC. Effect of chelating agents upon the synthesis of nucleic acids and protein: inhibition of DNA synthesis by 1-formylisoquinoline thiosemicarbazone. Biochem Biophys Res Commun 1967; 27: 26-32.

35) Sartorelli AC, Agrawal KC, Tsiftsoglou AS, Moore EC. Characterization of the biochemical mechanism of action of alpha-(N)-heterocyclic carboxaldehyde thiosemicarbazones. Adv Enzyme Regul 1976; 15: 117-139.

36) Durackova Z, Mendiola MA, Sevilla MT, Valent A. Thiohydrazone Copper (II) Complexes. The Relationship Between Redox Properties and Superoxide Dismutase Mimetic Activity. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 1999; 48: 109-116.

37) Rosenberg B, Van Camp L, Trosks JE, Mansour VH. Platinum Compounds : A New Class of Potent Antitumour Agents. Nature 1969; 222: 385.

38) Cardia MC, Begala M, Delogu A, et al. Synthesis and Antimicrobial Activity of Novel Arylideneisothiosemicarbazones. IL Farmaco 2000; 55: 93-98.

39) Luque de Castro MD, Cosan E, Perez-Bendito D, Valcarcel M. Analytical possibilities of 1,2-naphthoquinone 2-thiosemicarbazone. An Quim 1979; 75: 861–864.

40) Saha DK, Padhye S, Sinn E, Newton C. Synthesis, structure, spectroscopy and antitumor activity of hydroxynaphthoquinone thiosemicarbazone and its metal complexes against MCF-7 human breast cancer cell line. Indian J Chem, Sect A: Inorg., Bio-inorg., Phys.,Theor. Anal. Chem. 2002; 41: 279-83.

41) Malon M, Travnicek Z, Marysko M, et al. Metal complexes as anticancer agents 2. Iron(III) and copper(II) bio-active complexes with N6-benzylaminopurine derivatives. Inorg Chim Acta 2001; 323: 119-29.

42) Chan-Stier CH, Minkel D, Petering DH. Reactions of bis (Thiosemicarbazonato) Copper (II) Complexes with Tumor Cells and Mitochondria. Bioinorganic Chem 1976; 6: 203-217.

43) Cory JG, Chiba P. Combination Chemotheraphy Directed at The Components of Nucleoside Diphosphate Reductase, In Inhibitors of Ribonucleoside Diphosphate Reductase Activity. Eds.; Pergamon Press : Oxford, 1989; pp:245-264.

44) Cory JG., Cory AH., Rappa G., Lorico A., Liu M., Lin TS., Sartorelli AC., Structure - Function Relationships for a New Series of Prydine - 2 - Carboxaldehyde Thiosemicarbazones on Ribonucleotide Reductaze Activity and Tumour Cell Growht in Culture and in vivo, Adv. Enz.Regul, 35, 55-68, (1995).

45) Finch RA, Liu MC, Cory AH, et al. Triapine (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone; 3-AP). An inhibitor of ribonucleotide reductase with antineoplastic activity. Adv Enzyme Regul 1999; 39: 3-12.

46) Rajabi H, Joshi MD, Jin C, Ahmad R, Kufe D. Androgen receptor regulates expression of the MUC1-C oncoprotein in human prostate cancer cells. Prostate 2011; doi: 10.1002/pros.21344.