Gereç ve Yöntem: Çalışmada A2780, PC-3 ve LNCaP hücre hatları kullanıldı. Tüm hücre hatları ACA’nın 1 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM ve 100 μM’lik konsantrasyonları ile 24 saat süreyle inkübe edildi. Hücre canlılığında meydana gelen değişiklikler 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) yöntemiyle incelendi. MTT deney sonuçlarına göre inhibe edici logaritmik konsantrasyon 50 (LogIC₅₀) değerleri hesaplandı.

Bulgular: 24 saat süreyle ACA ile inkübe edilen kanser hücrelerinin (A2780, PC-3 ve LNCaP) canlılıklarında önemli azalmalar olduğu görüldü (P<0.05). ACA’nın kültür ortamına eklenen tüm konsantrasyonlarının A2780 hücre canlılığında azalmaya neden olduğu (P<0.05), PC-3 ve LNCaP hücrelerinde ise ACA’nın 1 μM hariç tüm konsantrasyonlarının 24 saat süreyle hücre canlılığını azalttığı tespit edildi (P<0.05). Ayrıca LogIC₅₀ değerlerine bakıldığında ACA’nın daha düşük konsantrasyonda en güçlü sitotoksik aktiviteye LNCaP hücreleri üzerinde gösterdiği belirlendi.

Sonuç: ACA’nın A2780, PC-3 ve LNCaP hücreleri üzerinde sitotoksik aktiviteye sahip olduğu görüldü. Bu durum ACA’nın antitümör özelliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır

N-(p-amylcinnamoyl) antranilik asit (ACA) hem Transient Receptor Potential Melastatin-2 (TRPM2) hem de Fosfolipaz A2 (PLA2) inbitörüdür ^4,5. Transient Receptor Potential (TRP) kanal ailesinin bir üyesi olan Transient Receptor Potential Melastatin (TRPM) kanalları, hücre proliferasyonu ve hayatta kalımı ile ilgili önemli rollere sahiptir ⁶. TRPM kanallarının 8 üyesinden biri olan TRPM2 kanalları kalsiyum (Ca⁺⁺) geçirgen non-selektif katyon kanalıdır. Adenozin difosfat riboz (ADPR) ve oksidatif stresle aktive edilir. Kanalın oksidatif stresle aktive olmasıyla hücre içi Ca⁺⁺ seviyesi düzenlenir. Aynı zamanda bu durumun hücre hasarıyla ilişkili olduğu düşünülmektedir ⁷. TRP süperailesinin birçok patoloji için tedaviye yönelik potansiyeli gün geçtikçe ortaya çıkmaktadır. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda TRP kanallarının çeşitli insan kanser tipleri ile ilgili önemli rolleri olduğu gösterilmiştir ^8-10. TRPM2 kanal ekspresyonunun bazı kanser türlerinde arttığı gösterilmiştir ¹¹.

PLA₂’nin inflamasyon, hücre ölümü, hücre büyümesi, hücre sinyali ve membran fosfolipitlerinin onarılması gibi çok sayıda fonksiyonu vardır ¹². Çeşitli çalışmalarda insanlarda görülen kanser türlerinde PLA₂ ekspresyonunun arttığı gösterilmiştir ^13,14. PLA₂’nin farklı kanser türlerinde anjiogenez ve tümor büyümesi ile ilişkili olduğuna dair artan deliller bulunmaktadır ^15,16. PLA₂ inhibisyonunun ise farklı hayvan modellerinde tümör gelişimini ve büyümesini azalttığı gösterilmiştir ^17-20.

Bu çalışma in vitro olarak TRPM2 ve PLA₂ inbitörü ACA’nın İnsan over (A2780) ve prostat kanseri (PC-3 ve LNCaP) hücre canlılığı üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla yapıldı.

ACA’nın Hazırlanışı ve Kültür Ortamına Eklenmesi: ACA (Enzo Life Sciences, New York, USA) Dimethilsülfioksit (DMSO) içerisinde çözülerek 1, 5, 25 50 ve 100 μM’lık konsantrasyonlar hazırlandı. Hazırlanan ACA konsantrasyonları ile aynı miktarlarda çözücü DMSO hücrelerin içinde bulunduğu kuyucuklara ilave edildi ve CO₂ inkübatöründe 24 saat süreyle 37 ⁰C’de inkübasyona bırakıldı.

MTT Assay: Sitotoksik etkiler, sitotoksisitenin değerlendirilmesinde çok yaygın olarak kullanılan enzimatik test yöntemlerinden biri olan MTT yöntemi ile belirlendi. Bu yöntem, MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır. Bu yöntemde, MTT canlı hücrelere aktif olarak absorbe olur ve reaksiyon mitokondriyal süksinat dehidrogenaz tarafından katalize edilerek mavi-mor renkli, suda çözünmeyen formazana indirgenir. Formazan oluşumu, yalnızca aktif mitokondrinin bulunduğu canlı hücrelerde görülmektedir. Bu da hücre canlılığının bir belirteci olarak kabul edilir ve spektrofotometrik olarak belirlenen değer, yaşayan hücre sayısı ile ilişkilendirilir ^21,22. Steril PBS içerisinde hazırlanan stok MTT solüsyonundan, 0.5 mg/mL MTT çalışma solüsyonu hazırlandı ve 96 kuyucuklu plaklara ilave edildi. İnkübatörde 3 saat bekletildikten sonra plakalardaki hücrelerin optik dansiteleri, ELISA cihazında (Synergy HTX, ABD) 550nm dalga boyunda okutuldu ²³. Kontrol kuyucukları okutularak, elde edilen absorbans değerlerinin ortalaması alındı ve bu değer %100 canlı hücre olarak kabul edildi. DMSO ve ACA uygulanan kuyucuklardan elde edilen absorbans değerleri, kontrol absorbans değerine oranlanarak ve yüzde canlılık değerleri belirlendi. Elde edilen MTT assay sonuçlarına göre inhibe edici 50 (IC₅₀) ve logaritmik inhibe edici 50 (LogIC₅₀) değeri bilgisayar ortamında Graphpad prism 6 programı kullanılarak hesaplandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Prostat LNCaP hücre hattına ACA uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (a, b, istatistiksel olarak birbirinden farklı; P<0.05)

PC-3 hücrelerine uygulanan ACA’nın hücre canlılığı üzerinde meydana getirdiği etkileri Şekil 2’de gösterilmiştir. Yapılan istatistiksel analiz sonrası ACA’nın 5, 25, 50 ve 100 μM’lık konsantrasyonlarının hücre canlılığında azalmaya neden olduğu görüldü ve azalmanın özellikle 25, 50 ve 100 μM’lık konsantrasyonlarda 5 μM uygulanan gruba göre daha fazla olduğu belirlendi (P<0.05). DMSO ve 1 μM ACA uygulanan gruplardaki hücrelerin canlılık değerleri kontrol grubundaki hücreler ile benzer orandaydı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Prostat PC-3 hücre hattına ACA uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (a, b, c istatistiksel olarak birbirinden farklı; P<0.05)

ACA’nın A2780 hücreleri üzerinde meydana getirdiği canlılık oranları Şekil 3’de gösterilmiştir. ACA’nın çözücüsü olan DMSO hücre canlılığında kontrol grubuna kıyasla önemli bir etki meydana getirmez iken ACA’nın tüm konsantrasyonlarının hücre canlılığını azalttığı görüldü (P<0.05). 24 saat süre ile uygulanan ACA’nın doz bağımlı (5 ve 50 μM hariç) sitotoksik aktiviteye sahip olduğu gözlendi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: İnsan over A2780 hücre hattına ACA uygulanmasından 24 saat sonra hücre canlılık oranlarında meydana gelen % değişiklikler (a, b, c, d istatistiksel olarak birbirinden farklı; P<0.05)

24 saat süre ile ACA’nın, A2780, PC-3 ve LNCaP hücrelerinin canlılık oranlarında meydana getirdiği değişikliklere bağlı olarak GraphPad 6 Prizm programında hesaplanan ACA’nın LogIC₅₀ ve IC₅₀ değerleri ayrıca Tablo 1’de sunulmuştur.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: ACA’nın LogIC50 ve IC50 değerleri

Kanser, dünya genelinde giderek artan bir sağlık problemidir ve toplumlarda önemli bir sosyo-ekonomik yüke, bireylerde de maddi ve manevi kayıp ve zorluklara yol açmaktadır. Yeni yayımlanan dünya kanser istatistiklerine göre; ölüm nedenleri arasında kanser ilk sırada yer almaktadır ²⁵. Dünyada 2012 yılında 14 milyon yeni kanser vakası, 8,2 milyon kanserden ölüm bildirilmiştir. Gelecek 20 yılda yeni vaka beklentilerinin %70 civarında artacağı düşünülmektedir ²⁶. Türkiyede, prostat kanseri erkeklerde en çok görülen kanser türleri arasında 2. Sıradadır (%11.8). Over kanseri ise kadınlarda en çok görülen kanser türleri arasında 7. Sıradadır (%3.9) ³.

Günümüzde kanser tedavisinde kullanılan ilaçların birçoğu sitotoksiktir. Sitotoksik ilaçların sadece kanser hücrelerini değil, aynı zamanda normal vücut hücrelerini de etkiledikleri bilinmektedir. Bundan dolayı kanser tedavisinde umut veren bazı ilaçların vücuda zararlı etkileri de olmaktadır. Bu sebeble kanser hücrelerine yönelik daha spesifik yeni ajanların tasarlanmasına ihtiyaç duyulmaktadır ²⁷.

ACA ilk olarak lökotrien C4 ve D4 antagonisti olarak bronkokonstriksiyon etkisiyle tanınmıştır ²⁸. PLA2 inhibisyonu gerçekleştirdiği ortaya konan ACA’ nın; PLA2 inhibitör aktivitesi yanında daha sonra pankreas adacıklarında glikoz ile gerçekleşen insülin salgısını inhibe ettiği gösterilmiştir ²⁹. Daha sonraki yıllarda yapılan çalışmalarda ACA’nın TRPM2 kanallarını bloke ettiği gösterilmiştir. ACA’nın etkisi daha zayıf olsa da aynı zamanda TRPC6 ve TRPM2 kanalıyla yakın ilişkili olan TRPM8 kanalını inhibe ettiği gösterilmiştir ⁵.

TRPM2 kanalları kalsiyum geçirgen non-selektif katyon kanalıdır. TRPM2 kanalı, kanala bağlı olarak hücre içinde enzim bulundurması ve oksidatif stresle aktive olması nedeniyle spesifik bir iyon kanalıdır. TRPM kanalları hayatta kalım ve proliferasyon gibi çeşitli hücresel fonksiyonları olan TRP kanal ailesinin üyesidir ³⁰. TRPM kanallarından biri olan TRPM2 vücutta birçok hücrede ekprese edilmiştir ³¹. TRPM kanallarının kanser hücrelerinde de ekspresyonu görülmüş olup ekspresyon seviyesinin tümör büyümesi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ³². Prostat kanseri hücrelerinde TRPM2 ekpresyonunun sağlıklı hücrelere göre arttığı gösterilmiştir. TRPM2 kanallarının inhibisyonunun ise bening prostat hücrelerinde proliferasyonu etkilemezken, PC-3 hücrelerinin proliferasyonu azalttığı gösterilmiştir ³³. Bao ve ark. ³⁴ yaptığı çalışmada TRPM2 kanallarının azalmasının tümör büyümesini inhibe edip doxorubicinin etkisini artırdığı gösterilmiştir.

PLA₂’nin hücre büyümesi, hücre ölümü ve inflamasyonun düzenlenmesi gibi çeşitli fonksiyonları vardır. PLA₂ izoformlarının aktivitesi ve ekspresyonunun çeşitli insan kanser türlerinde arttığı gösterilmiştir. PLA₂ inhibitörlerinin çeşitli kanser türlerinde tümör büyümesini azalttığı ortaya konmuştur ¹². Song ve ark. ^35, Schulte ve ark. ³⁶ yaptığı çalışmalarda PLA₂ inhibisyonunun over kanser hücrelerinde proliferasyonu baskıladığı rapor edilmiştir ³⁶. Sved ve ark. ³⁷ yaptığı çalışmada PLA₂ inhibisyonunun prostat kanser hücrelerinde proliferasyonu azalttığı gösterilmiştir.

TRPM2 ve PLA₂ inhibisyonunun anti-kanser özelliği göstermesi, hem TRPM2 hem de PLA₂ inhibitörü ACA’ya kanser hücrelerinin proliferasyonunu önlemede avantaj sağlamaktadır. Nitekim çalışmada PC-3, LNCaP ve A2780 hücrelerinde ACA uygulaması hücre canlılığını azaltmıştır. A2780 hücre hattında tüm konsantrasyonlarda istatistiksel olarak hücre canlılığını azaltmıştır. PC-3 (androjen reseptör bağımsız insan prostat kanser hücre hattı) ve LNCap (Androjen reseptör bağımlı insan prostat kanseri hücre hattı) kültür ortamına eklenen ACA’nın 1 μM dışındaki tüm konsantrasyonlarının istatistiksel olarak anti-kanser aktiviteye sahip olduğu görüldü. ACA’nın Hem PC-3 hem de LNCaP hücrelerinde aynı konsantrasyonlarda benzer etkiler göstermesi; bu etkinin androjen reseptöründen bağımsız olduğunu göstermektedir. Tahmini olarak hesaplanan ACA’nın LogIC₅₀ ve IC₅₀ konsantrasyonlarından yola çıkarak ACA’nın düşük konsantrasyonda en yüksek sitotoksik etkiyi sırasıyla LNCaP, PC-3 ve A2780 hücrelerinde gösterdiğini söylemek mümkündür.

Bu çalışmada, TRPM2 ve PLA₂ inhibitörü olan ACA’nın A2780, LNCaP ve PC-3 hücreleri üzerinde güçlü sitotoksik aktiviteye sahip olduğu görülmektedir. Bu sonuçlar insan over ve prostat kanseri tedavisinde ACA’nın önemli etkilere sahip olabileceğini işaret etmektedir.

1) Scott KF, Sajinovic M, Hein J, et al. Emerging roles for phospholipase A2 enzymes in cancer. Biochimie 2010; 92: 601-610.

2) Saatçi E. Dünyada ve Türkiye'de kanser epidemiyolojisi. Turkiye Klinikleri J Fam Med-Special Topics 2014; 5: 1-8.

3) Gultekin MBG, Utku ES, Ergun A, ve ark. Turkiye Kanser Istatistikleri. Ankara: T.C Saglik Bakanligi, Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, 2015

4) Harteneck C, Frenzel H, Kraft R. N‐(p‐Amylcinnamoyl) anthranilic Acid (ACA): A Phospholipase A2 Inhibitor and TRP Channel Blocker. Cardiovasc Drug Rev 2007; 25: 61-75.

5) Kraft R, Grimm C, Frenzel H, Harteneck C. Inhibition of TRPM2 cation channels by N-(p-amylcinnamoyl)anthranilic acid. Br J Pharmacol 2006; 148: 264-273.

6) Chen S, Hoffman NE, Shanmughapriya S, et al. A splice variant of the human ion channel TRPM2 modulates neuroblastoma tumor growth through hypoxia-inducible factor (HIF)-1/2α. J Biol Chem 2014; 289: 36284-36302.

7) Xie YF, Macdonald JF, Jackson MF. TRPM2, calcium and neurodegenerative diseases. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol 2010; 2: 95-103.

8) Ge R, Tai Y, Sun Y, et al. Critical role of TRPC6 channels in VEGF-mediated angiogenesis. Cancer Lett 2009; 283: 43-51.

9) Yee NS, Zhou WQ, Lee M. Transient receptor potential channel TRPM8 is over-expressed and required for cellular proliferation in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Letters 2010; 297: 49-55.

10) Zhu G, Wang X, Yang Z, et al. Effects of TRPM8 on the proliferation and angiogenesis of prostate cancer PC-3 cells in vivo. Oncol Lett 2011; 2: 1213-1217.

11) Zhao LY, Xu WL, Xu ZQ, et al. The overexpressed functional transient receptor potential channel TRPM2 in oral squamous cell carcinoma. Sci Rep 2016; 6: 38471.

12) Cummings BS. Phospholipase A2 as targets for anti-cancer drugs. Biochem Pharmacol 2007; 74: 949-959.

13) Denizot Y, Chianea T, Labrousse F, et al. Platelet-activating factor and human thyroid cancer. Eur J Endocrinol 2005; 153: 31-40.

14) Jiang J, Neubauer BL, Graff JR, et al. Expression of group IIA secretory phospholipase A2 is elevated in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma. Am J Pathol 2002; 160: 667-671.

15) Nakanishi M, Rosenberg DW. Roles of cPLA2alpha and arachidonic acid in cancer. Biochim Biophys Acta 2006; 1761: 1335-1343.

16) Wen ZH, Su YC, Lai PL, et al. Critical role of arachidonic acid-activated mTOR signaling in breast carcinogenesis and angiogenesis. Oncogene 2013; 32: 160-170.

17) Cai Q, Zhao Z, Antalis C, et al. Elevated and secreted phospholipase A(2) activities as new potential therapeutic targets in human epithelial ovarian cancer. FASEB J 2012; 26: 3306-3320.

18) Linkous A, Geng L, Lyshchik A, Hallahan DE, Yazlovitskaya EM. Cytosolic phospholipase A2: Targeting cancer through the tumor vasculature. Clinical Cancer Research 2009; 15: 1635-1644.

19) Patel MI, Singh J, Niknami M, et al. Cytosolic phospholipase A2-alpha: a potential therapeutic target for prostate cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: 8070-8079.

20) Thotala D, Craft JM, Ferraro DJ, et al. Cytosolic PhospholipaseA2 Inhibition with PLA-695 Radiosensitizes Tumors in Lung Cancer Animal Models. PLoS One 2013; 19; 8: e69688.

21) Carlstrom K. Influence of Intratumoral estradiol biosynthesis on estrogen-receptors. Recent Results in Cancer Research 1984; 91: 145-9.

22) Henderson BE, Ross R, Bernstein L. Estrogens as a Cause of human cancer - the Richard-and-Hinda-Rosenthal-Foundation Award Lecture. Cancer Research 1988; 48: 246-53.

23) Osborne CK. Tamoxifen in the treatment of breast cancer. N Engl J Med 1998; 339: 1609-18.

24) Richard M, Kumar V, Abbas A, Fausto N. Pocket Companion to Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. Philadelphia: Elsevier, Saunders, 2006.

25) Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer 2015; 136: E359-386.

26) Bakar C. Dünyada ve Türkiye'de kanser epidemiyolojisi. Turkiye Klinikleri J Med Genet-Special Topics 2017; 2: 49-59.

27) Tekin S, Beytur A, Çakır M, Tekin Ç, Sandal S. Saksagliptin ve sitagliptinin farklı tip insan kanser hücre canlığı üzerine etkilerinin araştırılması. FÜ Sağ Bil Tıp Derg 2017; 31: 111-116.

28) Nakai H, Konno M, Kosuge S, et al. New potent antagonists of leukotrienes C4 and D4. 1. Synthesis and structure-activity relationships. J Med Chem 1988; 31: 84-91.

29) Konrad RJ, Jolly YC, Major C, Wolf BA. Inhibition of phospholipase A2 and insulin secretion in pancreatic islets. Biochim Biophys Acta 1992; 1135: 215-220.

30) Shapovalov G, Lehen'kyi V, Skryma R, Prevarskaya N. TRP channels in cell survival and cell death in normal and transformed cells. Cell Calcium 2011; 50: 295-302.

31) Miller BA, Zhang WY. TRP Channels as Mediators of Oxidative Stress. Transient Receptor Potential Channels 2011; 704: 531-544.

32) Santoni G, Farfariello V. TRP channels and cancer: New targets for diagnosis and chemotherapy. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 2011; 11: 54-67.

33) Zeng X, Sikka SC, Huang L, et al. Novel role for the transient receptor potential channel TRPM2 in prostate cancer cell proliferation. Prostate Cancer Prostatic Dis 2010; 13: 195-201.

34) Bao L, Chen SJ, Conrad K, et al. Depletion of the human İon channel TRPM2 in neuroblastoma demonstrates its key role in cell survival through modulation of mitochondrial reactive oxygen species and bioenergetics. J Biol Chem 2016; 291: 24449-24464.

35) Song Y, Wilkins P, Hu W, et al. Inhibition of calcium-independent phospholipase A2 suppresses proliferation and tumorigenicity of ovarian carcinoma cells. Biochem J 2007; 406: 427-436.

36) Schulte RR, Linkous AG, Hallahan DE, Yazlovitskaya EM. Cytosolic phospholipase A2 as a molecular target for the radiosensitization of ovarian cancer. Cancer Lett 2011; 304: 137-143.

37) Sved P, Scott KF, McLeod D, et al. Oncogenic action of secreted phospholipase A2 in prostate cancer. Cancer Research 2004; 64: 6934-6940.