Gereç ve Yöntem: Çalışmada kullanılan 28 adet Sprague-Dawley erkek sıçanlar Kontrol, DOX, DOX+HST ve HST olmak üzere 4 gruba ayrıldı (n=7). DOX uygulaması intraperitoneal olarak 15 mg/kg tek doz yapıldı. HST uygulaması, 28 gün boyunca gün aşırı 50 mg/kg dozda oral gavaj yoluyla gerçekleştirildi. Deney sonunda dekapite edilen sıçanların serum örneklerinde total antioksidan seviye (TAS) ve total oksidan seviye (TOS)’leri belirlendi. Karaciğer dokularında histopatolojik değerlendirmeler için hematoksilen-eozin (H&E) boyaması yapıldı. Ayrıca DRP1 ve MFN2 immünreaktiviteleri için avidin-biodinperoksidaz yöntemi uygulandı. DRP1 ve MFN2 mRNA düzeylerinin tespiti için kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanıldı.

Bulgular: Kontrol grubuna kıyasla DOX grubunda TAS’lerinin azaldığı, TOS’lerinin arttığı, histopatolojik bulguların arttığı, DRP1 ekspresyon düzeylerinin arttığı ve MFN2 ekspresyon düzeylerinin azaldığı belirlendi (P<0.05). Buna karşın, DOX grubuna kıyasla DOX+HST grubunda ise TAS’lerinin arttığı, TOS’lerinin azaldığı, histopatolojik bulguların azaldığı, DRP1 ekspresyon düzeylerinin azaldığı ve MFN2 ekspresyon düzeylerinin arttığı saptandı (P<0.05).

Sonuç: Mevcut çalışmadan elde edilen sonuçlar, HST'nin DOX ile indüklenen hepatotoksisite üzerindeki terapötik etkilerinde DRP1 ve MFN2’nin rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Son yıllarda kanser vakalarındaki önlemez artışa bağlı olarak DOX gibi güçlü kemoterapötik ilaçların toksik etkilerini önleyebilecek bileşiklerin keşfedilmesine yönelik çalışmalar artmıştır ⁶. Yüksek oranda oksidatif stres ile ilişkilendirilen DOX kaynaklı hepatoksisiteye karşı anti-oksidanlarla müdahale, DOX’un neden olduğu hasarın azaltılmasına yardımcı olabilir ⁷. Flavonoidlerin bir türü olan hesperetin (HST) (5,7,3'-trihidroksi-4-metoksil flavanon), güçlü bir radikal temizleyicidir ⁸. Çeşitli kemoterapötiklerin neden olduğu toksisitelere karşı HST'nin önleyici ve/veya iyileştirici etkileri bildirilmiştir ⁹. Ayrıca, HST’nin sıçanlarda DOX kullanımı nedeniyle bozulan oksidatif stres parametrelerini ve karaciğer enzim düzeylerini iyileştirdiği ortaya konulmuştur ¹⁰.

Mitokondriler enerji üretimi için kritik hücresel organeller olmanın yanı sıra hücresel sinyalizasyonda önemli roller oynarlar. Ayrıca, hepatositlerde yüksek oranda bulunmaları, onları ilaca bağlı hepatotoksisite için önemli hedefler haline getirir ¹¹. DOX aracılı artan ROT seviyeleri, mitokondriyal dinamiklerde değişikliklere yol açar ¹². Dahası, yapılan çalışmalar DOX'un mitokondriyal fonksiyon için hayati öneme sahip olan mitokondriyal füzyon ve fisyon arasındaki dinamik dengeyi bozduğunu göstermektedir ¹³. Mitokondriler için bir içsel kalite kontrol sistemi olan bu füzyon-fisyon dengesinin düzenlenmesinde Dynamin 1 Like (DRP1) ve Mitofusin 2 (MFN2) gibi mitokondri ile ilişkili genlerin rol aldığı bilinmektedir. Bunun yanı sıra, ROT üretimindeki artışın mitokondriyal gen ifadelerine zarar vererek mitokondriyal disfonksiyonu tetiklediği ve apoptoz ve/veya nekroz gibi ciddi olumsuz süreçlere neden olabileceği bildirilmiştir ¹⁴.

DOX kaynaklı hepatotoksisitede terapötik amaçlı hesperetin kullanımının DRP1 ve MFN2 gen ifadelerini nasıl etkilediği bilinmemektedir. Çalışmamızda, hesperetinin sıçan karaciğerinde doksorubisin ile indüklenen toksik etkilere karşı iyileştirici etkilerinin DRP1 ve MFN2 ile ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır.

Çalışmada 8-10 haftalık toplam 28 adet Sprague-Dawley erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar, Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırma Merkezinde suya ve standart kemirgen yemine serbest erişim olacak şekilde 22-25 °C'de 12 saat/12 saat karanlık/ışık rejimi altında tutuldu. Tüm sıçanlar aşağıdaki gibi rastgele 4 gruba ayrıldı (n=7): Grup 1: Kontrol; Grup 2: DOX; Grup 3: DOX+HST; Grup 4: HST. DOX uygulaması intraperitoneal olarak 15 mg/kg tek doz yapıldı. HST uygulaması, 28 gün boyunca gün aşırı 50 mg/kg'lık bir dozda (serum fizyolojikte çözdürülmüş) oral gavaj yoluyla gerçekleştirildi. Tüm uygulamalar deneyin ilk gününde başlatıldı. DOX ve HST uygulamalarının dozajı ve süresi önceki araştırmalara dayanmaktadır ^15,16. Deneyin sonunda, tüm sıçanlar ksilazin/ketamin anestezisi altında dekapite edildi. Öte yandan, her bir hayvana ait karaciğer doku örneklerinden bir kısmı histopatolojik değerlendirmeler için %10 formalin içinde fikse edilirken, bir diğer kısmı sıvı nitrojen içinde dondurularak moleküler analizler için -80 °C'de saklandı. Kan örneklerinden elde edilen serumlar biyokimyasal analizler için -20°C'de muhafaza edildi.

Total Antioksidan Seviye (TAS) ve Total Oksidan Seviye (TOS) Ölçümleri: Sıçan serum örneklerinde total antioksidan seviye (TAS) ve total oksidan seviye (TOS)’lerinin belirlenmesi için enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) uygulandı. Sıçanlara özgü TAS (YLA1389RA, YL Biont, Çin) ve TOS (YLA1372RA, YL Biont, China) ELISA kitleri kullanıldı. Analizler, kit içerisinde yer alan protokole uyularak gerçekleştirildi ve ölçümler spektrofotometre cihazı (Multiskan FC, Thermo Scientific) kullanılarak yapıldı.

Histolojik Analizler: 72 saat süreyle %10 formalin içinde fikse edilmiş sıçan karaciğer dokuları dehidre edildi, şeffaflaştırıldı ve parafine gömüldü. Daha sonra doku kesitleri rodajlı ve polilizinli lamlara alındı ve rodajlı lamlara alınan kesitler hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyandı. Boyanmış karaciğer kesitlerini incelemek için ışık mikroskobu kullanıldı. Farklı grupların karaciğer kesitlerinde histopatolojik farklılıklar değerlendirildi. Öte yandan, DRP1 ve MFN2 immünoreaktivitelerini tespit etmek için immünohistokimyasal boyama yöntemi kullanıldı ¹⁷. Bu analiz için DRP1 (Kat. No. ab184247, abcam) ve MFN2 (Kat. No. YID-3452 YLBiont, Shangai, China) primer antikorları kullanıldı.

Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PZR): DRP1 ve MFN2 mRNA düzeylerindeki değişiklikleri değerlendirmek için öncelikle Trizol reaktifi (MG-TRZ-01, Hibrigen, TÜRKİYE) kullanılarak sıçan karaciğer örneklerinden total RNA izole edildi ve elde edilen RNA örnekleri spektrofotometre ile miktar ve saflık açısından analiz edildi (BioSpec-nano, Shimadzu). Elde edilen RNA örnekleri OneScript cDNA sentez kiti (abm, Kanada) kullanılarak önerilen protokole göre komplementer DNA'ya (cDNA) dönüştürüldü. Son olarak, Kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) ABI 7500 Real-Time PCR cihazında (Applied Biosystems, Singapur) 2X Magic SYBR Mix (Procomcure, Avusturya) kullanılarak gerçekleştirildi. DRP1 ve MFN2 mRNA ekspresyon seviyelerini analiz etmek için referans gen olarak Gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kullanıldı (Tablo 1). mRNA ifadeleri arasındaki farklılıkların hesaplanması 2-ΔΔCt yöntemi ile gerçekleştirildi. qRT-PZR verilerinin analizi için “çevrimiçi Qiagen Gene Globe PCR veri analizi” yöntemi kullanıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde kullanılan primer dizileri

İstatistiksel Analiz: Elde edilen veriler ortalama±standart sapma olarak sunuldu. Diğer verilerin analizinde ise IBM SPSS 22.0 paket programında "One-way ANOVA ve post hoc Tukey" testi kullanıldı. P<0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Histopatolojik Değişiklikler: Kontrol ve HST gruplarındaki sıçanların H&E ile boyanmış karaciğer kesitlerinde v.sentralis, portal alanlar, hepatositler, sinüzoidler ve Kupffer hücreleri normal histolojik görünümdeydi (Şekil 2A,D). DOX grubuna ait karaciğer dokuları incelendiğinde; sinuzoidlerde dilatasyon ve konjesyon, hepatositlerde dejeneratif değişiklikler ve özellikle portal alanlarda daha yaygın olan inflamatuar hücre infiltrasyonu gözlendi (Şekil 2B). DOX+HST grubuna ait karaciğer dokularında ise sinusoidal dilatasyonun devam ettiği ancak konjesyonun önemli ölçüde azaldığı, hepatositlerin normale yakın bir görünüm sergilediği, hücre infiltrasyonunun belirgin bir şekilde azaldığı tespit edildi (Şekil 2C).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: DOX ve/veya HST tedavisinin serum TOS ve TAS düzeylerine etkisi. A. Serum TOS seviyeleri, B. Serum TOS seviyeleri. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Karaciğer histopatolojisi (H&E). A. Kontrol (x20). B. DOX (x20). C. DOX+HST (x20). D. HST (x20). Sinuzoidlerde dilatasyon ve konjesyon (siyah ok), hepatositlerde dejeneratif değişiklikler (ok başı) ve inflamatuar hücre infiltrasyonu (yıldız) gibi histopatolojik değişiklikler işaretlenmiştir.

Karaciğer DRP1 ve MFN2 İmmünreaktiviteleri: Polilizinli lamlara alınan karaciğer kesitlerine yapılan immünohistokimyasal boyanmanın sonucunda hepatositlerde hem DRP1 hem de MFN2 immünreaktiviteleri tespit edildi. Karaciğer dokusunda DRP1 immünreaktivitesi; Kontrol grubuyla kıyaslandığında, DOX+HST ve HST gruplarında benzerdi (sırasıyla P=0.334 ve P=0.947). Ancak DOX grubunda Kontrol grubuna kıyasla DRP1 immünreaktivitesinin istatistiksel olarak önemli düzeyde artmış olduğu tespit edildi (P=0.006).

MFN2 immünreaktivitesi açısından kontrol ve HST grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark gözlenmezken (P=0.502); DOX grubunda azalmış MFN2 immünreaktivitesi dikkat çekmekteydi (P=0.004). DOX+HST grubunda ise DOX grubuna kıyasla artmış (P=0.015), ancak kontrole kıyasla azalmış MFN2 immünreaktivitesi izlendi (P=0.034) (Şekil 3, 4).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Karaciğer dokusunda DRP1 ve MFN2 immünreaktivitesi. DRP1 ve MFN2’e ait immünohistokimyasal boyamalar. Kırmızı/kahverengi sitoplazmik boyanma immünpozitif hücreleri göstermektedir. Preparatlara Harris hematoksilen ile zıt boyama yapılmıştır (x20).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: Karaciğer dokusunda DRP1 ve MFN2 immünreaktivitesine ait histoskor. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Karaciğer DRP1 ve MFN2 mRNA Düzeyleri: DRP1 ve MFN2 mRNA düzeylerindeki değişiklikleri değerlendirmek için yapılan qRT-PZR analizi sonucunda kontrol ile karşılaştırıldığında DOX uygulamasının DRP1 mRNA ekspresyon düzeylerini kontrole kıyasla arttırdığı (P<0.001) ve MFN2 mRNA ekspresyon düzeylerini azalttığı tespit edildi (P<0.001). Buna karşı DOX+HST grubunda DOX grubuna kıyasla DRP1 mRNA ekspresyon düzeylerinin azaldığı (P<0.001), MFN2 mRNA ekspresyon düzeylerinin ise arttığı belirlendi (P<0.001) (Şekil 5).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 5: Karaciğer dokusunda DRP1 ve MFN2 mRNA düzeylerindeki değişiklikler. A. DRP1 mRNA seviyeleri, B. MFN2 mRNA seviyeleri. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Ayrıca DOX aracılı artan ROT seviyeleri, mitokondriyal disfonksiyona neden olur. Son yıllarda, DOX kaynaklı hepatotoksisitede önemli rol oynayabilecek alternatif mekanizmaları tespit etmek için yapılan araştırmalar daha çok mitokondriyal füzyon ve fisyon proteinlerine odaklanmıştır. Bunun yanı sıra antioksidan takviyelerinin, klinik çalışmalarda, DOX kaynaklı toksisiteye karşı koruma gösterdiği bildirilmiştir ²⁰.

Antrasiklinlerin, hücre hasarına yol açacak şekilde hücrelerin makromolekülleri ile etkileşime giren reaktif oksijen türleri oluşturmak için moleküler oksijen ile reaksiyona giren semikinon radikal ara ürünü oluşturduğu bilinmektedir ²¹. DOX uygulanan sıçanların karaciğerinde meydana gelen histopatolojik değişiklikler; doksorubisinden oluşan reaktif ara ürünün (doksorubisin semikinon) neden olduğu artan oksidatif strese bağlı olabilir. DOX ile birlikte HST uygulanmasının bu histopatolojik değişiklikleri azaltmasınının ve karaciğerdeki hasarı büyük oranda iyileştirmesinin, HST’nin antioksidan özelliğinden kaynaklandığını düşünmekteyiz.

Çalışmada DOX tedavisinin serum TAS düzeylerinde belirgin bir azalmaya, TOS düzeylerinde ise artışa neden olduğu belirlendi. DOX ile birlikte HST uygulanmış sıçanlar ise TAS düzeylerinde artış, TOS düzeylerinde ise azalma gösterdi. Bu durum DOX ile karaciğer dokusunda oksidatif hasarın oluştuğunu göstermekte ve karaciğerde meydana gelen histopatolojik değişiklikleri de desteklemektedir.

Mitokondrinin işlev bozukluğunun ATP üretiminde azalmaya, hücresel işlevlerde ve yapıda değişikliklere yol açtığı gösterilmiştir ²². DOX'un genel toksisitesi, ROT'un aşırı üretimi ve oksidatif stresle sıkı bir şekilde ilişkili olan mitokondrinin işlevselliğindeki bozukluklarla ²³ ilişkili görünmektedir ²⁴. Bu nedenle, mitokondriyal disfonksiyonun ortadan kaldırılması, DOX uygulanan sıçan modellerinde karaciğer hasarını iyileştirme potansiyeline sahiptir. Bhargava ve ark. ²² DRP1 inhibisyonunun mitokondriyal fisyonu bloke ederek iskemik böbrek hasarını iyileştirebileceğini belirtmişlerdir. Başka bir çalışmada DRP1 aracılı mitokondriyal fisyonun, DOX kardiyotoksisitesinin başlatılmasında rol oynadığı gösterilmiştir ²⁵. Ayrıca Dai ve ark. ^26, DRP1 aşırı ekspresyonunun ROT oluşumunu arttırdığını bildirmişlerdir. Çalışmada da yukarıdaki verilerle uyumlu şekilde DOX uygulamasıyla aşırı artan, HST tedavisi ile normal seviyelere düşen DRP1'in DOX'un neden olduğu karaciğer hasarında rol oynadığı düşünülebilir. Buna karşın MFN2, mitokondri füzyonunda önemli bir rol oynar ve mitokondriyal fonksiyon için kritiktir. Artan kanıtlar, MFN2 ekspresyonundaki artışa bağlı mitokondriyal füzyonun mitokondriyal işlevi optimize etmeye hizmet ettiğini göstermektedir. Örneğin, MFN2 baskılanması mitokondrinin parçalanmasına yol açarken, MFN2'nin indüksiyonu ROT seviyelerini düşürür ve ATP seviyelerini düzenler ²⁷. DOX kaynaklı hepatoksisitede artan DRP1 ve azalan MFN2 düzeyleri bu hasarın mekanizmasında mitokondriyal fisyon-füzyon dengesinin bozulmasının gerçekleştiğini kanıtlar niteliktedir.

Literatürde DOX ile indüklenmiş karaciğer hasarına karşı güçlü bir antioksidan olan HST’nin etkilerinin ve bu etkide mitokondriyal füzyon-fisyon dengesinin düzenlenmesinde oldukça önemli olan DRP1 ve MFN2’nin rolünün araştırıldığı çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmanın ana sonucu, HST'nin DOX kaynaklı oksidatif stresi inhibe edebildiğidir. Ayrıca HST, karaciğerde DOX ile indüklenen histopatolojik değişiklikleri iyileştirir. Öte yandan, DRP1 ve MFN2’nin bu etkilere aracılık ettiği düşünülebilir.

1) Sonmez MF, Cilenk KT, Karabulut D, et al. Protective effects of propolis on methotrexate-induced testis injury in rat. Biomedicine & Pharmacotherapy 2016; 79: 44-51.

2) Ayla S, Seckin I, Tanriverdi G, et al. Doxorubicin induced nephrotoxicity: Protective effect of nicotinamide. Int J Biochem Cell Biol 2011; 1-9.

3) Damodar G, Smitha T, Gopinath S, Vijayakumar S, Rao YA. An evaluation of hepatotoxicity in breast cancer patients receiving injection doxorubicin. Ann Med Health Sci Res 2014; 4: 74-79.

4) Ibrahim HG, Attia N, Hashem FZA, Heneidy MAR. Cerium oxide nanoparticles: In pursuit of liver protection against doxorubicin-induced injury in rats. Biomed Pharm 2018; 103: 773-781.

5) Yagmurca M, Bas O, Mollaoglu H, et al. Protective effects of erdosteine on doxorubicin-induced hepatotoxicity in rats, Arch Med Res 2007; 38: 380-385.

6) Ludke AR, Al-Shudiefat AA, Dhingra S, Jassal DS, Singal PK. A concise description of cardioprotective strategies in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Can J Physiol Pharmacol 2009; 87: 756-763.

7) Wali AF, Rashid S, Rashid SM, et al. Naringenin regulates DOXorubicin-induced liver dysfunction: impact on oxidative stress and inflammation. Plants 2020; 9: 550.

8) Pollard SE, Whiteman M, Spencer JP. Modulation of peroxynitrite-induced fibroblast injury by hesperetin: A role for intracellular scavenging and modulation of ERK signalling. Biochem Biophys Res Commun 2006; 347: 916-923.

9) Iranshahi M, Rezaee R, Parhiz H, Roohbakhsh A, Soltani F. Protective effects of flavonoids against microbes and toxins: The cases of hesperidin and hesperetin. Life Sci 2015; 137: 125-132.

10) Hozayen WG, Abou Seif HS, Amin S. Protective effects of ruitn and/or hesperidin against DOXorubicin-induced hepatotoxicity. Int J Clin Nutr 2014; 2: 11-17.

11) Ramachandran A, Visschers RG, Duan L, Akakpo JY, Jaeschke H. Mitochondrial dysfunction as a mechanism of drug-induced hepatotoxicity: Current understanding and future perspectives. J Clin Transl Res 2018; 4: 75.

12) Yeh Y, Liu TJ, Wang LC, et al. A standardized extract of Ginkgo biloba suppresses DOXorubicin-induced oxidative stress and p53-mediated mitochondrial apoptosis in rat testes. Br J Pharmacol 2009; 156: 48-61.

13) Marechal X, Montaigne, Marciniak C, et al. Doxorubicin-induced cardiac dysfunction is attenuated by ciclosporin treatment in mice through improvements in mitochondrial bioenergetics. Clin Sci 2011; 121: 405-413.

14) Ikeda Y, Shirakabe A, Maejima Y, et al. Endogenous DRP1 mediates mitochondrial autophagy and protects the heart against energy stress. Circ Res 2015; 116: 264-278.

15) Lee KM, Lee IC, Kim SH, et al. Melatonin attenuates doxorubicin‐induced testicular toxicity in rats. Andrologia 2012; 44: 796-803.

16) Trivedi PP, Tripathi DN, Jena GB. Hesperetin protects testicular toxicity of DOXorubicin in rat: role of NFκB, p38 and caspase-3. Food Chem Toxicol 2011; 49: 838-847.

17) Tektemur A, Ozaydin S, Onalan EE, et al. TRPM2 mediates distruption of autophagy machinery and correlates with the grade level in prostate cancer. J Cancer Res Clin Oncol 2019; 145: 1297-1311.

18) Kuzu M, Yıldırım S, Kandemir FM, et al. Protective effect of morin on doxorubicin-induced hepatorenal toxicity in rats. Chem Biol Interact 2019; 308: 89-100.

19) Hajra S, Patra AR, Basu A, Bhattacharya S. Prevention of doxorubicin (DOX)-induced genotoxicity and cardiotoxicity: Effect of plant derived small molecule indole-3-carbinol (I3C) on oxidative stress and inflammation. Biomed Pharm 2018; 101: 228-243.

20) Dirks‐Naylor AJ, Kouzi S, Bero JD, et al. Doxorubicin alters the mitochondrial dynamics machinery and mitophagy in the liver of treated animals. Fundam Clin Pharmacol 2014; 28: 633-642.

21) De Beer EL, Bottone AE, Voest EE. Doxorubicin and mechanical performance of cardiac trabeculae after acute and chronic treatment: A review. Eur J Pharmacol 2001; 415: 1–11.

22) Bhargava P, Schnellmann RG. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol 2017; 13: 629.

23) Marques-Aleixo I, Santos-Alves E, Oliveira PJ, et al. The beneficial role of exercise in mitigating doxorubicin-induced mitochondrionopathy. Biochim Biophys Acta Rev Cancer 2018; 1869: 189-199.

24) Rato L, Alves MG, Cavaco JE, Oliveira PF. High‐energy diets: a threat for male fertility? Obes Rev 2014; 15: 996-1007.

25) Wang JX, Zhang XJ, Feng CSTK, et al. MicroRNA-532-3p regulates mitochondrial fission through targeting apoptosis repressor with caspase recruitment domain in DOXorubicin cardiotoxicity. Cell Death Dis 2015; 6: 1677.

26) Dai CQ, Guo Y, Chu XY. Neuropathic Pain: The Dysfunction of DRP1, Mitochondria, and ROS Homeostasis. Neurotox Res 2020; 1-11.

27) Chen Y, Lv L, Jiang Z, Yang H, Li S, Jiang Y. Mitofusin 2 protects hepatocyte mitochondrial function from damage induced by GCDCA. PloS One 2013; 8: 654-655.