Araştırma ve Yayın Etiği: Çalışmanın etik kurul onayı Recep Tayyip Erdoğan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Başkanlığından alındı (protokol No:2021/16).
Hayvanlar: Çalışmada 12 haftalık 21 adet Wistar albino ırkı dişi sıçan kullanıldı. Sıçanlar üç gruba ayrıldı (n=7). Sırasıyla, I) Kontrol, II) Stres (S) III) Geraniol (GE) +S. Benzer ağırlıklara sahip sıçanlar ısı (23±1 ℃, 50±5 % nem) ve ışığı (12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü) standardize edilen laboratuvar koşullarında barındırıldı. Kısıtlama stres protokolünün uygulandığı zaman dilimleri haricinde sıçanlara yiyecek ve su kısıtlaması yapılmadı.
Kısıtlama Stres Prosedürü: Bir haftalık adaptasyondan sonra kontrol grubu haricindeki sıçanlara KKS paradigması uygulandı. Kısıtlama stres aparatı 23 x 6,5 x 6,5 cm boyutlarında şeffaf pleksiglas malzemeden yapılmıştır. Stres protokolü önceki bir çalışmadan modifiye edilmiştir 14. Buna göre, KKS 3 hafta süreyle her gün 5 saat olarak uygulandı. Sıçanlar her kısıtlama stresi uygulamasını takiben normal kafeslerine geri bırakıldı.
Açık Alan Testi: Açık alan testi, kemirgenlerde kaygı benzeri davranışları değerlendirmek için kullanılmaktadır 15. Bu test için kullanılan aparat, koyu gri zemin ve iç duvarlara sahip kare şeklinde pleksiglas kutudan (90 × 90 × 40 cm) oluşmaktadır. Test alanı yazılım ekranında 10 cm'lik küçük karelere bölünerek merkez alan ve kenar bölgeleri belirlendi. Veriler, davranış izleme yazılım programı ANY-maze ile kayıt altına alındı (ANY-maze 5.2, Dublin/İrlanda). Deney aşamasında sıçanlar sırasıyla arenanın ortasına bırakıldı ve davranışları 5 dakika boyunca kaydedildi. Platform her bir testten sonra %70 etanol solüsyonu ile temizlendi, böylece her bir sıçanın davranışı önceki deneğin koku, idrar vb. kalıntılarından etkilenmesinin önüne geçildi. Sıçanların kat ettikleri toplam mesafe (m), ortalama hız (m/s), toplam hareketsizlik (immobilizasyon) süresi (s), merkezde geçirilen süre (s) ve merkeze erişim sayısı puanlandı. Tımarlanma ve şahlanma sayıları manuel olarak skorlandı.
Zorunlu Yüzme Testi: Bu test kemirgenlerde depresyon benzeri davranışları değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan deneysel bir test protokolüdür 16. Deneyde kullanılan aparat standart ölçülerde (30 cm çapında, 60 cm yüksekliğinde) şeffaf pleksiglas malzemeden yapılmıştır. Sıçanlar sırasıyla 40 cm su (27±1 °C) ile doldurulmuş bir silindirde 6 dakika süreyle yüzmeye bırakıldı. Sıçanlar tipik olarak kaçmak için mücadele davranışı sergiler, ancak bir süre sonra başını suyun üzerinde tutmak için küçük hareketler yaparak hareketsiz kalır ve bu durum davranışsal çaresizlik durumunu yansıtır. Bu test kaçış imkânı olmayan su dolu bir silindirde sıçanların hareketsizlik, yüzme ve tırmanma gibi davranışlarının değerlendirmesini içerir.
Biyokimyasal Analizler: Biyokimyasal analizler için hipokampus doku homojenatları kullanıldı. Bu amaçla dokular fosfat tampon solüsyonu (pH 7.4) içinde homojenize edildi. Elde edilen homojenatlar, 10.000 x g'de 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüje edildi. Daha sonra elde edilen süpernatantlar biyokimyasal analizler için kullanıldı.
Asetilkolin Düzeylerinin Belirlenmesi: ACh, hipokampustan elde edilen doku homojenatlarında üreticinin tavsiyelerine göre sıçan spesifik ELISA kiti (No: E-EL-0081, Elabscience) kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar ng/g doku cinsinden sunuldu.
Asetilkolinesteraz Aktivitesinin Belirlenmesi: AChE seviyeleri ELISA kiti (E-EL-R0355, Elabscience) kullanılarak belirlendi. Örneklerdeki protein konsantrasyonu, Bradford yöntemine göre analiz edildi 17. Sonuçlar U/mg protein cinsinden verildi.
İstatistiksel Analiz: Analizler GraphPad Prism 8.0 programı ile gerçekleştirildi. Veriler ortalamanın standart hatası (ortalama ±SEM) olarak sunuldu. Verilerin normal dağılıma uyup uymadıkları Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Normal dağılım gösteren verilere tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından çoklu karşılaştırma için post hoc Tukey testi uygulandı. p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.