[ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]
Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Tıp Dergisi
2005, Cilt 19, Sayı 3, Sayfa(lar) 193-197
[ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
ATEROSKLEROZDA APOLİPOPROTEİN E, OKSİDE-LDL VE LİPİD PROFİLİ İLİŞKİSİNİN ARAŞTIRILMASI
Bedia AĞAÇHAN1, Hülya YILMAZ1, Oğuz ÖZTÜRK1, H.Arzu ERGEN1, C.Selim İSBİR2
1İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü Moleküler Anabilim Dalı, İstanbul – TÜRKİYE
2Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Kalp Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, İstanbul – TÜRKİYE
Anahtar Kelimeler: Myokard infarktüsü, okside LDL, Apolipoprotein E, polimorfizm, lipid profili
Özet
Bu çalışmada lipoprotein metabolizmasındaki önemli görevlerinden dolayı, Apolipoprotein E gen polimorfizmi ve ateroz gelişindeki önemi sebebiyle okside LDL (Ox-LDL) düzeyleri kontrol grubu ve myokard infarktüsü (MI) geçirmiş bireylerde saptanarak, bu hastalıkların gelişimi ile ilişkileri araştırılmıştır.

12 kontrol ve 49 myokard infarktüsü tanısı konmuş hastada Ox-LDL ELİSA yöntemiyle tayin edildi. Periferik kan lökositlerinden elde edilen DNA örneklerinden apo E gen polimorfizmini saptamak için Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR), Restriksiyon Fragmanı Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment Lenght Polymorphism, RFLP) ve agaroz jel elektroforezi teknikleri kullanıldı. İstatiksel analiz için SPSS paket programı kullanılarak yapıldı.

Çalışmamızda myokard infarktüs tanısı konmuş olgularda apoε4 allelinin frekansı (%14.3) sağlıklı gruba göre (%8.3) yüksek bulunmuş, fakat istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (p>0.05). Ayrıca hasta grubunda okside LDL düzeylerinin (275.40+240.44 mU/ml) kontrol grubuna (190.71+60.15 mU/ml) göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek olduğu saptanmıştır (p<0.05). HDL dışında (p=0.033) lipid profillerinin gruplar arasındaki değişimi istatistiki açıdan anlamlı bulunmamıştır (p>0.05).

Çalışma sonucunda Apo ε4 allelinin ve okside LDL düzeylerinin aterosklerozda etkili olduğu izlenimi edinilmiştir.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Giriş
    Son yıllarda ateroskleroz patogenezinde rol oynayan genetik ve çevresel faktörler üzerindeki çalışmalar, araştırmacıların odak noktası haline gelmiştir. Ateroskleroz, hayatın erken evrelerinde başlayarak orta yaş ve sonrasında koroner arter hastalığı (KAH) ile sonuçlanan bir hastalık olarak tanımlanmakta ve endüstrileşmiş toplumlarda ölüm nedenlerinin başında yer aldığı rapor edilmiştir 1.

    Genetik faktörler, lipoprotein düzeylerini etkileyerek aterosklerozun oluşumunda önemli bir rol oynar 2. Lipoproteinlerin plazma düzeyleri ve metabolik hızları, yüzeylerinde bulunan apolipopro-teinler tarafından kontrol edilmektedir. Apolipopro-teinlerdeki genetik değişimlerin, KAH’nın gelişiminde bireylerarası farklılıkları belirleyen en önemli faktörlerden biri olduğu bir çok araştırmacı tarafından gösterilmiştir 3-4.

    Apolipoprotein E (apo E) düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) reseptörleri için ligand olarak görev yapan ve bu reseptörlerle etkileşimi sonucu çeşitli vücut hücrelerindeki kolesterol ve diğer lipidlerin taşınmasına katılan bir plazma proteini olduğu bildirilmiştir 5. Apolipoprotein E geni 19. kromozom üzerinde yer almaktadır ve apoprotein CI (apo CI) ve bir apo CI pseudogenine bağlıdır. LDL reseptör geni ve apo CII geni de bu kromozomda yer almaktadır. Apo E ’nin üç esas izoformunun, tek bir gen lokusunda üç allelin (ε2, ε3, ε4) ürettiği Apo Ε2 ,Ε3 ve Ε4 olduğu kabul edilmiştir 5-7.

    Çeşitli toplumlarda yapılan çalışmalarda, apoE4’ün yüksek plasma total ve düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterolü ve koroner arter hastalığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir 8. Apo ε2 allelinin ise serum trigliserid düzeylerinde artışa neden olduğu öne sürülmüştür 5. Koroner arter hastası erkeklerde izoelektrik odaklama ve Western Blotlama ile yapılan apo E fenotipleme çalışmalarında, plazma total ve LDL-kolesterol düzeyi apoE fenotipi izleyen şu sıraya göre arttığı gösterilmiştir: E3/2 < E3/3 < E3/4 < E4/4. Myokard infarktüslü hastaların rölatif sıklığının da aynı sıraya göre arttığı bildirilmiştir 9,10. ApoE4 alleline sahip bireylerin koroner arter hastalığının daha ciddi tiplerine sahip oldukları ayrıca bu hastaların daha sık infarktüs geçirdikleri gözlenmiştir. Bu çalışmalar ApoE alleli ε4‘ün ateroz için bir risk faktörü olduğunu ayrıca apoE4 allelinin koroner arter hastalığının şiddetini belirlediğini göstermektedir 10,11.

    Aterosklerotik lezyonların meydana geldiği endotelial hücrelerinde, düz kas hücrelerinde makrofajlarda ve lenfositlerde LDL okside olabilme özelliğine sahiptir İlk çalışmalarda okside-LDL (ox-LDL)’nin makrofajlarda kolesterol toplanmasına neden olarak proaterojenik özellik gösterdiği bildirilmiş ve aterojenik oluşumda LDL oksidasyonun önemli bir basamak oluşturduğu hipotezi kurulmuştur 12,13. Daha sonraki çalışmalarda ox-LDL ‘nin aterojenitede buna ek olarak pek çok katkıları olduğu saptanmıştır 14. LDL’nin kültüre endotel hücrelerinde oksidatif modifikasyonundan dolayı sitotoksik olduğu ve bunun kesinlikle aterojenik olduğunu gösterilmiştir 15. Ox-LDL’nin makrofajlardan makrofaj koloni stimülan faktör (M-CSF) ve monosit kemoatraktan protein-1 (MCP-1) serbestleşmesini stimüle ettiği ve bu maddelerin monositlerin toplanmasına neden olarak yağ çizgi lezyonlarının oluşumunu kolaylaştırdığı tespit edilmiştir 16,17. Biyokimyasal ve immünohistokimyasal çalışmalarda LDL'nin aterosklerotik lezyonlarda okside olduğu gösterilmiştir 15.

    Apo ε4 eksik C57BL/6 sıçanlarda yapılan çalışmalarda okside LDL'nin hiperkolestorelemiye bağlı olarak şiddetli aterosklerosize sahip hastalarda relatif olarak yüksek antikor düzeyleri gösterdiği saptanmıştır 16,17. Ancak bunun kesinlik kazanması ve karanlık noktaların aydınlatılması için daha kapsamlı çalışmalara gereksinim vardır. Bu bilgilerin ışığı altında myokard infarktüsü geçirmiş olgularda apo E genine ait polimorfizm ile okside LDL düzeylerinin araştırılması planlanmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Materyal ve Metot
    Seçilen örneklerin tanımı: Bu çalışmada iki örnek grubu kullanılmıştır. Birinci grupta yüksek tansiyon ve kalp rahatsızlığı hikayesi olmayan 12 sağlıklı birey kontrol grubuna alınmıştır.

    İkinci grup 49 myokard infarktüsü geçirmiş hastadan oluşmaktadır. İlgili birimlerce hastaların seçiminde izlenilen kriterler aşağıda özetlenmiştir.

    Kontrol Grubu: Herhangi bir iskemik kalp hastalığı bulgusu, hipertansiyon, lipid anomalisi, metabolik rahatsızlık (DM, böbrek yetersizliği, karaciğer (KC) yetersizliği vs., ailede bilinen erken yaş iskemik kalp hastalığı lipid metabolizma bozukluğu ve hipertansiyon bulgusu olmayanlar kontrol grubuna alınır.

    İskemik kalp hastalığı: Eğer hasta myokard infarktüsü geçirmişse veya anjina var fakat myokard infarktüsü geçirmemişse tanı amacıyla farmakolojik stres testi veya MIBI ile myokard perfüzyonuna bakılır. Eğer negatifse çalışma grubuna dahil edilmemiştir. Eğer pozitifse hasta Koroner kalp hastası kabul edilip anjiyografi önerilmiş (tanıyı koyan birim tarafından), çalışma grubuna alınmıştır.

    Kan örneklerinin alınması: DNA izolasyonu için kan örnekleri steril EDTA’lı tüplere alınmış ve en geç bir gün içinde çalışmak üzere oda ısısında saklanmıştır.Serum lipid profili tayinleri için üç gruba ait kan örnekleri 16 saat açlık sonrası kuru tüpe alınmış ve 3000 rpm’de 10 dakika santrifüj edilerek serumları ayrılmıştır. Serum örnekleri analizleri yapılana kadar -20 ºC’de saklanmıştır. Periferik kandan DNA saflaştırılması için steril EDTA’lı tüplere kan örnekleri alınmış ve en geç bir gün içinde çalışmak üzere oda ısısında saklanmıştır 18.

    PCR Yöntemiyle DNA’da Apo E Gen Bölgesinin Çoğaltılması: Üç gruba ait DNA örneklerinden Apolipoprotein E gen bölgesinin çoğaltılması için 50 µl hacminde PCR karışımı hazırlandı. 32.625 µl ddH2O , 1.5 ünite Taq polimeraz enzimi , 5µl Taq Polimeraz enziminin çalışması için gereksinim duyduğu 10 x Reaksiyon çözeltisi , Apo gen bölgesine özgü 50 pmol primer çifti, 200 mM deoksinükleotid trifosfat karışımı (dNTP) kullanılarak PCR’ları gerçekleştirildi. Amplifiye olan PCR ürünleri Hha I Restriksiyon Endonükleaz enzimi ile kesildi. Kesim ürünlerinin %4’lük Metaphor agaroz’da elektroforezi tamamlandıktan sonra jel UV altında incelendi ve Polaroid kamera ile fotoğrafı çekildi 19.

    Serumda okside LDL düzeylerinin ELISA yöntemi ile tayini: Çalışmada OLAB firması tarafından geliştirilen ELISA kiti kullanılmıştır. Okside LDL düzeyleri Esterbauer (1989) 20 ve Tatzber (1991) 21 tarafından önerilen yönteme göre saptanmıştır. Sonuçlar ELİSA okuyucusunda 450 nm dalga boyunda okunduktan sonra çizilen standart eğriden mU/ml olarak hesaplanmıştır.

    Sonuçların Değerlendirilmesinde Kullanılan İstatistiksel Yöntemler
    Bu çalışmanın istatistiksel analizleri SSPS 10.0 paket programı kullanılarak yapılmıştır. İstatistiksel anlamlılık sınırı p<0.05 olarak alınmıştır.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Bulgular
    Sağlıklı ve myokard infarktüsü geçirmiş olgulara ait yaş ortalamaları ve gruplar arası vücut kütle indekslerinin karşılaştırılması tablo 1'de gösterilmiştir. Yaş ve vücut kütle indekleri açısından iki grup arasında fark olmadığı tespit edilmiştir (p>0.05).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 1: Gruplararası Yaş ve Vücut-kütle indekslerinin karşılaştırılması

    Myokard infarktüs tanısı konmuş olgularda okside LDL düzeyleri 275.40+240.44 mU/ml ve kontrol grubunda ise 190.71+60.15 mU/ml olarak saptanmıştır (Şekil 1). İstatistiki açıdan hasta grubunda okside-LDL düzeyleri anlamlı derecede yükseldiği gözlenmiştir (p=0.029) .


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 1: Gruplar Arası Okside LDL Düzeyleri Şekildeki değerler ortalama değer + standart sapma (X + SD) olarak verilmiştir. Gruplararası karşılaştırmalar student t testi ile yapılmıştır, n : örnek sayısı p=0.029

    Apo E fenotiplerinin 14 sağlıklı ve 49 myokard tanısı konmuş hastada yapılan gruplar arası karşılaştırmasında anlamlı fark bulunamamıştır (Tablo 2) (Şekil 2).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 2: Apo E genotiplerinin gruplara göre dağılımı


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Şekil 2: Apo E genotiplerinin metaphor agar jel elektroforezindeki görünümü

    Ayrıca apo ε4 alleli taşıma açısından gruplararası karşılaştırılması Tablo 3 te verilmiştir. Myokard infarktüsü geçirmiş grupta apo ε4 alleli taşıyanların frekansı kontrol grubuna göre artmış fakat istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (X2 =0.300 ; p>0,05).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 3: Apo ε4 alleli taşıma açısından sağlıklı grupla myokard infarktüsü geçirmiş hasta grubunun karşılaştırılması

    Tablo 4 te ise apo ε4 alleli taşıyanlar ile taşımayan bireylerin ox-LDL düzeyleri verilmiştir. Gruplara düşen örnek sayısı az olduğundan istatistiki çalışma yapılamamıştır.


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 4: Apo ε4 alleli taşıyanlar ile Okside LDL Düzeylerinin Karşılaştırılması

    Sağlıklı bireyler ile myokard infarktüsü geçirmiş olgulara ait serum lipid düzeyleri ise tablo 5'de verilmiştir. HDL dışında (p=0.033) lipid profillerinin gruplar arasındaki değişim istatistiki açıdan anlamlı değildir (p>0.05).


    Büyütmek İçin Tıklayın
    Tablo 5: Gruplararası ve Genel Lipid Profili Dağılımı

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Tartışma
    Plazma lipid düzeylerini etkileyen çok önemli faktörlerden biri olarak çalışma protokolümüze aldığımız apolipoprotein E 19. kromozomda yer alan üç yaygın alleli olan 34.000 dalton molekül ağırlıklı bir lipoprotein bileşenidir 22,23. Üç yaygın izoform olan apo E2, E3 ve E4 arasında 112. veya 158. pozisyonda yer alan tek bir aminoasit kalıntısında farklılık vardır. Çalışmamızda sağlıklı grupta apolipoprotein E allel frekansı sonuçları (E4/4 % 8.3, E3/4 % 0 , E3/3 % 83.3 , E2/3 % 8.3 , E2/2 % 0 , E2/4 % 0 ) hasta grubunda ise (E4/4 % 2.0, E3/4 % 12.2 , E3/3 % 73.5 , E2/3 % 10.2 , E2/2 % 2.0 , E2/4 % 0 ) olarak bulunmuştur. Çalışma gruplarımızdaki apo E genotip frekansları arasında anlamlı fark elde edilememiştir.

    Apo ε4 alleli taşıyan sağlıklı grupta okside LDL düzeyi taşımayanlara oranla daha yüksek olduğu bulunmuştur. Myokard infarktüsü geçirmiş olgularda ise önemli bir değişim gözlenmemiştir. Bu bulgumuzun nedeninin örnek sayımızın azlığından kaynaklandığı izlenimi elde edilmiştir. Ancak myokard infarktüsü geçirmiş grupta apo ε4 alleli taşıyan grup sağlıklı apo ε4 alleli taşıyan grup ile kıyaslandığında hasta grupta okside LDL düzeylerinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu bulgumuz endotelial hücrelerin okside LDL artan monosit makrofaj ve T lenfosit gibi ajanların 14 yapışması yanında apo ε4 allellerininde zedelenmede ve fonksiyonlarının bozulmasının da rol alabileceği izlenimini uyandırmaktadır.

    Apo ε4 alleli taşıyan bireylerde total kolesterol, LDL kolesterol ve VLDL kolesterol düzeyleri düşük trigliserid düzeyleri ise yüksek olduğu gözlenmiştir. Apo ε4 alleli taşıyan bireylerde ise total kolesterol, VLDL kolesterol, HDL kolesterol apo ε2/3 ve ε 3/3'e oranla yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu bulgumuz Mahley ve ark.24 ile uyum içerisinde olduğu gözlenmiştir.

    Okside LDL düzeyleri genel HDL ve LDL değerleri esas alınarak yapılan sınıflamada değişken bir dağılım göstermiştir. Bu bulgumuzun örnek sayısı azlığından kaynaklandığı görüşündeyiz.

    Sonuç olarak; myokard infarktüsü tanısı konmuş hasta grubunda apo ε4 allelinin serum lipid profilinde neden olduğu değişiklikler yanında okside LDL ile olan muhtamel bağlantının bu hastalığa yatkınlıkta önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir.

    Çalışmamızdan elde ettiğimiz sonuçlara göre apo ε4 alleli ile okside LDL düzeyleri arasındaki ilişkisinin daha geniş bir populasyonda araştırılmasının aterosklerotik koroner hastalıklara yatkınlığın aydınlatılması bakımından önemli olduğu kanısına varılmıştır.

    Teşekkür
    Bu çalışma İ.Ü. Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No : 1211/181298

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • Kaynaklar

    1) Farmer JA., Gotto A. Risk factor for coronary artery disease. In: Braunwald Heart Disease A Textbook of cardiovascular medicine. 4th ed An HBJ International Edition, 1992; Volume 1, Chapter 37, 1125-55.

    2) Castelli WP. Lipids, risk factors and ischaemic heart disease. Atherosclerosis 1996;124 Suppl.: S1-S9.

    3) Azad K, Court S, Parkin JM, Laker MF, Alberti KG. Lipid levels in schoolchildren in North East England : effects of feeding and age. Ann Clin Biochem 1994;31 : 233-9.

    4) PDAY Research Group: Relationship of atherosclerosis in young men to serum lipoprotein cholesterol concentrations and smoking. JAMA 1990; 264 : 3018-24.

    5) Mahley RW. Apolipoprotein E : Cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1988;240 : 622-30.

    6) Weisgraber KH., Innerarity TL., Harder KJ, etal. The receptor-binding domain of human apolipoprotein E . Monoclonal antibody inhibition of binding. J Biol Chem 1983; 258 / 20: 12348-54.

    7) Zannis VI, Breslow JL. Human very low density lipoprotein Apolipoprotein E isoprotein polymorphism is explained by genetic variation and posttranslational modification. Biochemistry 1981;20 : 1033-41.

    8) Lenzen HJ., Assman G, Buckwalsky R, Schulte H. Association of apolipoprotein E polymorphism , low density lipoprotein cholesterol, and coronary artery disease. Clin Chem 1986;32 / 5 : 778-81.

    9) Braeckman L, De Bacquer D, Rosseneu M, De Bacquer G. Apolipoprotein E polymorphism in middle-aged Belgian men : phenotype distribution and relation to serum lipids and lipoproteins. Atherosclerosis 1996;120 : 67-73.

    10) Davignon J, Greeg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis . Atherosclerosis 1988;8: 1-21.

    11) Hixson JE and the Pathological Determinants of Atherosclerosis in Youth (PDAY) Research Group: Apolipoprotein E polymorphism affect atherosclerosis in young males. Arterioscler Thromb 1991;11 :1237-44.

    12) Raitaki OT, Pitkanen OP, Lethimaki T, etal. In vivo low density lipoprotein oxidation relates to coronary reactivity in young men. J Am Coll Cardiol 1997; 30:97-102,

    13) Holvoet P, Collen D. Oxidation of low density lipoprotein in the pathhogenesis of atherosclerosis. Atherosclerosis 1998;137 suppl:S33-S38.

    14) Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis : a perspective for the 1990s. Nature 1993;362 : 801-9.

    15) Mark T, Quin SP, Loren G, Fong DS. Oxidatively modified low density lipoptoeins:A potential role in recruiment and retention of monocyte /macrophages during atherogenesis. Proc.Natl Acad Sci USA 1987;84: 29995-98.

    16) David SL. Does an acidic PH explain why low density lipoprotein is oxidised in atherosclerotic lesions? Atherosclerosis 1997;129; 149-157.

    17) Joseph LW. Immunological response to oxidized LDL. Atherosclerosis 1997;131 suppl,S9-S11.

    18) Miller SA, Dykes DD, Polesky HS. Simples salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res. 1988;16 / 3 : 1215.

    19) Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jrgens G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Rad Biol Med 1992;13:341-390.

    20) Tatzber F, Rabl H, Koriska K et al: Elevated serum neopterin levels in atherosclerosis. Atherosclerosis 1991;89: 203-208.

    21) Mahley RW. Apolipoprotein E : Cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1988;240 : 622-30.

    22) Mahley RW, Weisgraber KH, Innerarity TL, Rall SC. Genetic defects in lipoprotein metabolism. Elevation of atherogenic lipoproteins caused by impaired catabolism. JAMA 1991;265 / 1 : 78-83.

    23) Mahley RW, Paloğlu KA, Atak Z, Dawson-Pepin J, Langlois AM: Turkish heart study. Lipids lipoproteins and apolipoproteins. J Lipid Res 1995;36, 839-59.

  • Başa Dön
  • Özet
  • Giriş
  • Materyal ve Metot
  • Bulgular
  • Tartışma
  • Kaynaklar
  • [ Başa Dön ] [ Özet ] [ PDF ] [ Benzer Makaleler ] [ Yazara E-Posta ] [ Editöre E-Posta ]
    [ Ana Sayfa | Editörler | Danışma Kurulu | Dergi Hakkında | İçindekiler | Arşiv | Yayın Arama | Yazarlara Bilgi | E-Posta ]