Primer amenoreli 62 olguda sitogenetik çalışma yapıldı. Olgular SRY geni FISH ve moleküler genetik yöntemler kullanılarak analiz edildi.

Kromozomal aberasyonlar 11 vakada bulundu. Kromozomal anomaliler müllerian kanal anomalilerinden sonra primer amenorenin en sık ikinci nedenidir. En sık kromozomal anomali 11 vakadan 7’sinde görülen Turner sendromudur. Erkek genotip ve inguinal testisli tam testiküler feminizasyonlu (ADS) 2 olguda tespit edildi. ADS’li 2 olguda SRY pozitifliği bulundu. Diğer olgularda SRY pozitifliğine rastlanmadı.

XY hücre hattı içeren bir karyotipin primer amenoreli bir olguda bulunması durumunda artmış neoplazi riskinden dolayı gonadoktomi önerilmelidir. Turner sendromu primer amenorenin yaygın olmayan bir nedenidir. Kısa boy TS’li dişilerde değişmeyen bir bulgudur. Biyosentetik büyüme hormonuyla tedavinin, TS’li olguların çoğunda yetişkin boy artışında etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle çocukluk ve adolesan dönemde TS’nin erken tanısı oldukça önemlidir. Genetik danışmanlık hastaların durumu kabullenmesi açısından gerçekçi olmalıdır. Böylece hastaların toplumda fiziksel, psikolojik, duygusal ve sosyal olarak uyum sağlamalarına yardımcı olunabilir.

Bunun yanı sıra hipotiroidizm veya hipertroidizm, kronik hastalıklar, kistik fibrosis, sürrenal hastalıklar (Cushing’s hastalığı), hipoglisemi, aşırı şişmanlık, diabetes mellitus, konjenital kalp hastalığı(cyanotic), konjenital adrenal hiperplazi, kraniofarinjiom, adrenal tümörler, Prader Willi sendromu, aşırı kilo kaybı (anorexia nervosa, bulimia, aşırı egzersiz, veya diğer nedenler) ve malnutrisyon gibi genel nedenlerden de kaynaklanabilir ³.

Primer amenorede kromozomal anomalilerin oranı farklı çalışmalarda farklı oranlarda bulunmuştur. Bu oranlar %15.9’la %63.3 arasında değişmektedir ^4-10. Bu farklılık muhtemelen farklı hasta seçim kriterlerinden kaynaklamaktadır. Bu güne kadar X ve Y kromozomu ile ilgili olarak pek çok yapısal anomali tanımlanmıştır ^11,12. Özellikle Turner sendromun (TS)’da X kromozomuyla ilgili olarak en sık rastlanılan kromozomal anomaliler 45,X , 45,X/46,XX , 46,X,i(Xq), 46,X,del(X), 46,X,r(X) ve 45,X/47,XXX şeklindedir ¹³. Primer amenoreli olgularda 46,XY karyotipi başta olmak Y kromozomunun delesyon ve duplikasyonlarının da yer aldığı kromozomal anomaliler saptanmıştır ¹². Androjen Duyarsızlığı Sendromu (ADS) X’e bağlı resesif geçiş gösteren bir sendromdur. Sendromda karyotip 46,XY olup olgularda inguinal testis yapısı ve belirsiz dış genitaller en belirgin özelliklerdir ¹⁴.

Çalışmada primer amenoreli bireylerde kromozomal anomalilerin saptanarak bu tür hastalarda farklı kromozomal anomalilerin (yeniden düzenlemelerin) yüzdesinin bulunması, SRY lokus spesifik prob kullanılarak yapılacak interfaz FISH çalışmasıyla Y kromozom kökenli dizilerin tespit edilmesi, SRY spesifik primerler kullanılarak yapılacak moleküler genetik analizle SRY pozitifliğinin değerlendirilmesi ve tespit edilen karyotipler ve fenotipler arasındaki ilişkilerin ortaya konması amaçlanmıştır.

FISH Analizi: İnterfaz-FISH çalışması TS’nin en azından 2 özelliğini (kısa boy, seksüel infantizim) taşıyan 34 ve erkek yönünde virilizasyonun belirlendiği 2 olguya yapıldı. FISH için biotinle işaretli sentromerik X ve teksas red işaretli SRY genine spesifik dual-color kokteyl bir prob kullanıldı (Vysis, Illinois, USA). Preparasyon işlemleri Vysis protokolüne uygun olarak yapıldı. Mozaiklik varlığının ve SRY pozitifliğinin değerlendirilmesi için 100 interfaz hücresi floresan mikroskopta incelendi ¹⁵.

Moleküler Analiz: Moleküler genetik herhangi bir kriter uygulanmaksızın 62 hastaya uygulandı. Gerekli olan olgu DNA’ları kandan standart yöntemlerle elde edildi. SRY bölgesinin çoğaltılmasında ileri primer olarak 5’ CGATTGTCCTACAGCTTTGTC-3’ ve geri primer olarak 5’- TCGCACTCTCCTTGTTTTTTGAC-3’ kullanıldı ¹⁶. PZR cihazında çift sarmal DNA moleküllerini denatüre etmek için bir döngüde 96ºC’de 3 dakika, denatürasyon (melting) için 96ºC’de 30 saniye, bağlanma (annealing) için 60ºC’de 1 dakika, uzama (extension) için 72ºC’de 1 dakika olmak üzere toplam 35 döngü gerçekleştirildi. En son döngüdeki uzatma periyodu 72ºC’de 10 dakika olacak şekilde gerçekleştirildi ve örnekler 4ºC’ye kadar hızla soğutuldu. PZR sonucunda elde edilen 648bp’lik PZR ürünü % 2’lik agaroz jelde yürütüldü.

İstatistik Analizler: Yaş ve diğer demografik veriler SPSS 10 programına kaydedildi. Tüm İstatistik analizler bu programla gerçekleştirildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Primer amonore'li hastalarda tespit edilen karyotipler ve karşılık gelen sendromlar.

9 karyotipin 5’i TS’nin fenotipik özelliklerine sahip olup 3’ünde klasik olmayan Turner karyotipleri bulundu. 2 hastada 46,XY karyotipi tespit edildi ve bunlar androjen duyarsızlığı sendromunun klinik özelliklerine sahipti. Tablo 2’de primer amenorenin etyolojik nedenleri verilmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Primer amenorenin etyolojisi.

Del(X)(q23)’ü gösteren metafaz plağı Şekil 1’de gösterilmiştir. Yapılan interfaz FISH çalışması sonucunda sadece 2 ADS’li olguda SRY pozitifliği tespit edilmiştir. Yapılan interfaz FISH görüntüsü Şekil 2’de gösterildi. Yapılan moleküler genetik analizlerle bu 2 ADS’li olguda 648bp’lik PZR ürünü gösterilmiştir. Olgulara ait agaroz jel görüntüsü Şekil 3’de verilmiştir. Anormal karyotip tespit edilen diğer olgularda SRY pozitifliğine rastlanmamıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: 46, X,del(X)(q23) karyotipine sahip olgunun metafaz plağı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: SRY lokus spesifik kırmızı işaretli ve sentromerik X yeşil işaretli prob kullanılarak yapılan interfaz FISH sonucu elde edilen sinyallere sahip interfaz hücresi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: SRY genine spesifik primerler kullanılarak yapılan PZR sonrası elde edilen ürünlerin agoroz jel görüntüsü. Sütun 1: 100bp'lik DNA boyut markırı. Sütun 2: 46,XY karyotipine sahip normal bir erkeğe ait 648bp'lik bant. Sütun 3,4,5,7: SRY negatif olgular. Sütun 6: ADS'li olguya ait SRY bandı. Sütun 8: Negatif kontrol.

Temocin ve arkadaşları 68 primer amenoreli hastanın %26.4 ¹⁸’inde, Ganguly ve Sahni primer amenoreli 280 hastanın %29’unda, Chryssikopoulos ve Grigoriou 77 primer amenoreli hastanın %38’inde ve Mondal ve arkadaşları 72 primer amenoreli vakanın %33.33’ünde sitogenetik olarak anormal bir karyotip tespit etmişlerdir. Anormal karyotipler içerisinde en sık TS karyotipi ve varyantlarının görüldüğünü ikinci sırada ise ADS’nin yer aldığını belirtmişlerdir ^4,8-10. Bu çalışmada olguların %17.7’sinde anormal karyotip tespit edilmiş olup anormal karyotipe sahip olguların %63.6’sında TS ve varyantlarında görülen kromozomal anomaliler ve %18’inde ise 46,XY karyotipi saptanmıştır.

TS’lu bireylerde moleküler düzeyde Y kromozom materyalinin varlığı tespit edilmiş olup bu materyalin varlığı değişik çalışmalarda %12, %28 ve %36 gibi farklı oranlarda bulunmuştur ^17,18. TS veya Ullrich Turner Sendromu (UTS) hastalarında bir Y kromozom materyalinin varlığında gonadoblastom veya disgerminom gelişme riski %10-%20 iken ADS’li olgularda bu oran yaklaşık %30’dur ¹⁹. Primer amenoreli hastalarda yapılan moleküler genetik analizler sonucunda SRY pozitifliği ADS’li 2 olguda tespit edilmiştir. SRY pozitifliğinin özellikle Turner sendromlu bireylerde rutin olarak araştırılması önerilmektedir. ADS’li 2 olguda inguinal testis dokusu tespit edilmiş olup her iki olguda tam ADS sendromunun özelliklerini göstermektedir. Bu hastalara sitogenetik ve klinik olarak tanı konduktan sonra özellikle gonadların malignant potansiyelinden dolayı prepubertel gonadoktomi yapılmalıdır. Her iki olguda da genetik danışmanlık verilerek hastalar gonadoktomi işlemi için cerrahi kliniklerine yönlendirilmiştir.

Marozzi ve arkadaşları Xq23 delesyonuna sahip prematür ovarian yetmezliği olan ve Turner stigmatları olmayan bir olgu ve Mesa-Cornejo ve arkadaşları ise 45,X(6)/46,X,del(X)(q23)(24) karyotipine sahip TS’li bir olgu tanımlamışlardır ^20,21. Ayrıca Xq23 bölgesindeki delesyonlara sahip mozaik olmayan olgularda Turner stigmatlarının gözlenmediğini belirten çalışmalar mevcuttur ²². Aynı karyotipe sahip olgumuzda ise kısa boy, boyun olmasına rağmen obezite ve menarş gözlenmemiştir. Olgumuzda hipertiroidi ve işitme kaybı gibi Turner sendromunun tipik özellikleri de tespit edilmiştir. Hipertiroidi Turner sendromlu olguların ancak %3’ünde görülmektedir ²³. Hipertiroidinin olgu 5’te görülmesi karyotip-fenotip korelasyonları açısından oldukça önemlidir. Literatürde mozaik olmayan Xq23 delesyonuna sahip ve bahsedilen Turner sendromu özelliklerini taşıyan olguya rastlanmamıştır. Olguyu diğer Xq23 delesyonuna sahip vakalardan farklı kılan özelliklerinin nedenlerini açıklamak oldukça güçtür. Çünkü normal olarak anormal X kromozomu tercihen inaktive edilmeli ve böylece genetik denge korunmalıdır. Ancak Xq delesyonuna sahip bireylerde X inaktivasyonunun random olduğunu veya bunun tersi şekilde Xq- açısından seçimli bir inaktivasyonun gerçekleştiğini gösteren çalışmalar mevcuttur ^24,25,26. Fenotipin değişken olmasının en önemli nedenlerinden biri Xp veya Xq’nun proksimalindeki gelişim genlerinin, bazı X-otozomal kromozom translokasyonlarında görülen X inaktivasyonunun değişken yayılmasına benzer şekilde inaktive olmasıdır ²⁷.

X kromozomuyla ilgili anomalilerin yanı sıra 2 olguda 9 nolu kromozomda inversiyon gözlenmiştir. Daha önce Ganguly ve Sahni adlı araştırıcılarda primer amenoreli olgularda bu anomaliye rastlamışlardır ⁸. Badovinac ve arkadaşları reproduktif başarısızlığı olan bireylerde (158 erkek ve 106 dişi) yaptıkları çalışmada aynı anomaliyi 4 bireyde tespit etmişlerdir. Bu anomali normal varyant olarak kabul edilmekle beraber primer amenoreye katkısı henüz bilinmemektedir ²⁸.

Kromozomal anomaliler müllerian kanal anomalilerinden sonra primer amenorenin en sık nedenlerindendir. Sitogenetik çalışmalar jinekolojik ve endrokrinolojik çalışmalar için temel oluşturmaktadır. Bu nedenle hastaların klinik tanısı sitogenetik ve klinik çalışmalara göre yapılmalıdır. Tanıyı takiben genetik danışmanlık sürecinde hastalara olabildiğince hastalıklarını kabullenmeleri doğrultusunda bilgiler aktarılmalıdır. Turner Sendromun’da erken tanı ve tedaviler bu olguların hayat standartlarını artırmakta ve yetişkinlikte yaşayacakları kısa boy gibi bazı problemlerin önüne geçebilmektedir. Bu nedenle Turner Sendrom tanısının çocukluk ya da adolesan dönemde konması için hastalığın kısa boy ve gelişim geriliği gibi özelliklerinin göz önünde bulundurularak kromozom analizine yönlendirilmelerinin hastalığa erken dönemde tanı konmasına yardımcı olacaktır.

Teşekkür
Çalışmayı destekleyen Fırat Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri kurumuna teşekkür ederiz.

1) Timmreck LS, Reindollar RH. Contemporary issues in primary amenorrhea. Obstet Gynecol Clin North Am 2003; 30: 287-302.

2) Pletcher JR, Slap GB. Menstrual disorders. Amenorrhea. Pediatr Clin North Am 1999; 46: 505-518.

3) Kiningham RB, Apgar BS, Schwenk TL. Evaluation of amenorrhea. Am Fam Physician 1996; 53:1185-1194.

4) Temocin K, Vardar MA, Suleymanova D, et al. Results of cytogenetic investigation in adolescent patients with primary or secondary amenorrhea. J Pediatr Adolesc Gynecol 1997; 10: 86-88.

5) Roy AK, Banerjee D. Cytogenetic study of primary amenorrhoea. J Indian Med Assoc 1995; 93: 291-292.

6) Joseph A, Thomas IM. Cytogenetic investigations in 150 cases with complaints of sterility or primary amenorrhea. Hum Genet 1982; 61:105-109.

7) Opitz O, Zoll B, Hansmann I, Hinney B. Cytogenetic investigation of 103 patients with primary or secondary amenorrhea. Hum Genet 1983;65:46-47.

8) Ganguly BB, Sahni S. X chromosomal abnormalities in Indian adolescent girls. Teratog Carcinog Mutagen 2003;1:245-253.

9) Chryssikopoulos A, Grigoriou O. The etiology in 77 primary amenorrhea patients. Int J Fertil 1987; 32: 245-249.

10) Mondal SK, Guha D, Banerjee D, Sinha SK. Study of primary amenorrhoea with special reference to cytogenetic evaluation. Indian J Pathol Microbiol 2002; 45: 155-159.

11) Ogata T, Matsuo N, Fukushima Y, et al. FISH Analysis for apparently simple terminal deletions of the X chromosome: identification of hidden structural abnormalities. Am J Med Genet 2001; 311: 104-307.

12) Kotzot D, Dufke A, Tzschach A, et al. Molecular breakpoint analysis and relevance of variable mosaicism in a woman with short stature, primary amenorrhea, unilateral gonadoblastoma, and a 46,X,del(Y)(q11)/45,X karyotype. Am J Med Genet. 2002 ;15:51-55.

13) Gravholt CH, Juul S, Naeraa RW, Hansen J. Prenatal and postnatal prevalence of Turner\'s syndrome: a registry study. BMJ 1996; 312:16-21.

14) Gottlieb B, Pinsky L, Beitel LK, Trifiro M. Androgen insensitivity. Am J Med Genet 1999; 89: 210-217.

15) Rooney DE, Czepulkowski BH. Human Cytogenetics. 2. Edition. New York: Oxford Universty Pres: 1992.

16) Gicquel C, Gaston V, Cabrol S, Le Bouc Y. Assessment of Turner’s Syndrome by Molecular Analysis of the X Chromosome in Growth-Retarded Girls. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1998; 83: 1472-1476.

17) Lopez M, Canto P, Aguinaga M, et al. Frequency of Y chromosomal material in Mexican patients with Ullrich- Turner syndrome. Am J Med Genet 1998; 76: 120-124.

18) Canto P, Chesnaye E, Lopez M, et al. A mutation in the 5’non-high mobility group box region of the SRY gene in patients with Turner Syndrome and Y mosaicism. The Journal of Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 1908-1911.

19) Verp MS, Simpson JL. Abnormal sexual differentiation and neoplasia. Cancer Genet Cytogenet 1987; 25: 191-218.

20) Marozzi A, Manfredini E, Tibiletti GM, et al. Molecular definition of Xq common-deleted region in patients affected by premature ovarian failure. Hum Genet 2000; 107: 304–

21) Mesa-Cornejo VM, Garcia-Cruz D, Monroy-Jaramillo N, et al. Del Xq23 in a Mosaic Turner Female: Molecular and Cytogenetic Studies. Ann Genet 2001; 44:171–174.

22) Maraschio P, Tupler R, Barbierato L, et al. An analysis of Xq deletions. Hum Genet 1996; 97: 375–381.

23) Elsheikh M, Dunger DB, Conway GS, Wass JAH. Turner’s syndrome in Adulthood Endocr Rev 2002; 23:120–140.

24) Rosenberg T, Niebuhr E, Yang HM, Parving A, Schwartz M. Choroideremia, congenital deafness and mental retardation in a family with an X chromosomal deletion. Ophtalmic Pediatr Genet 1987; 8: 139-143.

25) Cremers FP, van de Pol TJ, Wiering B. Molecular analysis of male-viable deletions and duplications allows ordering of 52 DNA probes on proximal Xq. Am J Hum Genet 1988; 43: 452-461.

26) Wolff DJ, Gustashaw KM, Zurcher V. Deletions in Xq26.3- q27.3 including FMR1 result in a severe phenotype in a male variable phenotypes in females depending upon the X inactivation pattern. Hum Genet 1997; 100: 256-261.

27) Gererkens C, Just W, Vogel W. Deletions of Xq and growth deficit: a review. Am J Med Genet 1994; 2: 105-113.

28) Badovinac AR, Buretic-Tomljanovic A, Starcevic N, et al. Chromosome Studies In Patients With Defective Reproductive Success. Am J Reprod Immunol 2000; 44: 279-283.