Elektriksel alan stimülasyonu ile indüklenen sıçan ileum preparatlarının kontraktil yanıtlarında α 2- adrenoseptör agonisti klonidinin inhibitör etkisi üzerinde NO'in rolü araştırıldı. İn vitro izole sıçan ileum preparatlarının kullanıldığı çalışmada ortamda NO prekürsörü L-arginin (L-Arg) (10-4м), NO sentaz inhibitörü L-nitro-arjinin-methyl ester (L-NAME) (10-4м) ve alfa 2-adrenoseptör antagonisti yohimbinin (10-6м) farklı kombinasyonlarının bulundurulduğu farklı serilerde klonidinin (10-8-10- 5M) kümülatif dozlarda elektriksel alan stimülasyonuna verilen kasılma yanıtları üzerine olan etkileri incelenmiştir.

Klonidinin artan dozlarında meydana getirdiği gevşeme yanıtları ortamda yohimbinin bulundurulması durumunda bozulmuştur. Farklı bir seride ortamda L-arg bulundurulması durumunda gevşeme yanıtlarında belirgin bir artış kaydedilirken L-NAME bulundurulması durumunda gevşeme yanıtları üzerinde belirgin bir değişikliğe neden olmamıştır. Ortamda L-Arg bulundurulması halinde klonidinin elektriksel stimülasyon ile elde edilen kasılma yanıtları üzerine olan inhibitör etkinliğinin artması nedeniyle klonidin ve NO'in muhtemelen sıçan ileumunun elektriksel olarak uyarılan gevşeme yanıtları üzerinde etkileşebileceği sonucuna ulaşılmıştır.

Gastrointestinal motor aktivitenin koordinasyonu ve modülasyonu iki kompleks nöronal inputa bağlıdır: barsak duvarı içinde tamamiyle intrinsik enterik sinir sistemi ve etkisini sindirim sistemine ekstrinsik sinirler (vagal, sempatik) aracılığıyla gönderen santral sinir sistemi. İntestinal sempatik sinir sistemi prevertebral gangliada yer alan ve postgangliyonik lifleri ile barsaklara giren sinir hücrelerinden ibarettir ⁶. Hepsi olmasa da çoğunluğu motiliteyi etkileyen sempatik postgangliyonik liflerin direkt olarak düz kas hücrelerine değil, enterik sinir sisteminde sinaps yaptığı düşünülmektedir. Daha önce de adrenerjik sinirlerin barsaktaki nonsfinkter kas hücrelerinde direkt olarak sinaps yapmadığı öne sürülmüş ^7, ancak farklı çalışmalarda sıçan jejunum ve ileumunda adrenerjik inputa, enterik sinir sisteminden ziyade ağırlıklı olarak adrenerjik aracılı motor mekanizmalar tarafından aracılık edildiği gösterilmiştir ^8,9.

Gastointestinal kanalda α 2-adrenoseptörler intestinal motiliteyi kontrol eden önemli presinaptik reseptörler olarak bilinirler ^10,11. Çeşitli hayvan türlerinde ve insanlarda ¹² yapılmış olan deneysel çalışmalarda ve klinik gözlemlerde ^13,5, klonidinin intestinal motilite üzerine inhibitör etki ettiği bildirilmiştir ¹⁴. Uygun modeller üzerinde yapılan çalışmaların yetersizliği nedeniyle klonidinin intestinal kasılmalar üzerine etkisinin mekanizması detaylı bir şekilde incelenmediği için henüz yeterli bir şekilde bilinmemektedir.

NO çeşitli dokularda L-argininden nitrik oksit sentaz tarafından sentezlenir. Nitrik oksit sentazın (NOS) üç izoformu bulunmaktadır. Bunlar sırasıyla; nöronal NOS (NOS I), indüklenebilir NOS (NOS II) ve endotelyal NOS (NOS III). Nöronal NOS (nNOS), NO salınımı için anahtar enzimdir ve myenterik pleksus ve santral sinir sisteminde saptanmıştır¹⁵. NO salınımı gastrointestinal kanal düz kaslarında gevşemeye neden olmaktadır.

Aynı zamanda nNOS ekspresyonunun sempatik sinir sistemi tarafından negatif olarak regüle edildiğini gösteren çalışmalar da bulunmaktadır ¹⁶. Ancak NO'i suprese eden sempatik sinir sistemi reseptörü henüz belirlenmemiştir.

NO myenterik pleksusta nöronal NOS aktivasyonu ile sentezlenir. Salınan NO gastrointestinal kanalın çeşitli bölümlerinde önemli fizyolojik rol oynar. nNOS ekspresyonundaki azalmanın lokal NO üretimini bozarak gastrointestinal kanalda motilite düzensizliklerine neden olabileceği gösterilmiştir ¹⁷.

Yapılan çalışmalarda klonidinin ileum kasılma yanıtlarını doza bağlı olarak düşürdüğü ¹⁸ ve LNAME'in in vivo olarak uygulanmasının klonidinin etkisini azalttığı gösterilmiştir ¹⁹.

Klonidinin hidrofobik heterosiklik NOS inhibitörleri ile yapısal benzerlik gösterdiği ve farklı yapılarda NOS I'i selektif olarak inhibe ettiği ve NOS II aracılı NO üretimini artırdığı ²⁰ ve NOS II ekspresyonunun artışının ileum kontraktilitesinde azalmaya neden olabileceği gösterilmiştir ²¹.

Gastrointestinal kanalda α 2-adrenoseptör ve NO sisteminin rolü göz önüne alınarak α 2-adrenoseptörlerin sıçan ileumunda NO sistemi ile muhtemel etkileşimi in vitro olarak araştırıldı.

Eter ile anestetize edilen sıçanlar eksanguinasyon ile sakrifiye edildi. Sakrifiye edilen sıçanların karın boşlukları longitudinal abdominal insizyon ile açılarak belirlenen ileum mezenterden ayrılarak izole edildi ve Magnus Yöntemine ¹³ göre 2-3 cm'lik tüp şeritler şeklinde kesildi. Her bir preparat ayrı bir deneysel protokol için kullanıldı. Doku şeritleri aynı gün içinde kullanıldı.

Her grupta her iki cinsten sıçan preparatı eşit şekilde kullanılmıştır. Her bir sıçandan hazırlanan preparatların her birine farklı prosedür uygulandı ve gün içinde kullanım sıralarının homojenize edilmesi amacıyla prosedürlerin sıralamaları düzenli bir şekilde değiştirildi (Tablo 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Çalışmamızda oluşturulan gruplar ve madde derişimleri.

Deney süresince hayvan hakları ile ilgili olarak Amerika Birleşik Devletleri Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından belirlenen kriterlere özenle uyuldu.

Deneyde kullanılan Tirod Solüsyonunun bileşimi: NaCl 139.2mmol/lt, KCl 2.7 mmol/lt, NaH2PO4 0.4 mmol/lt, CaCl2 1.8 mmol/lt NaHCO3 11.9 mmol/lt, MgCl2 0.49 mmol/lt, Glukoz 5.5 mmol/lt.

Dokular 10 ml tirod solüsyonu içeren organ banyosuna asıldı. İleum şeritlerine 1 g gerilim uygulanarak iki adet platin tel elektrod arasına yerleştirildi ve elektrotların dokuya direkt olarak temas etmesi sağlandı. Banyo solüsyonu 37ºC ısıda tutuldu ve sürekli olarak havalandırıldı. İlaç uygulanmasından önce 15'er dakikada bir yıkama yapılmak koşulu ile dokular 45 dakika dinlendirilerek banyo ortamına adapte olmaları sağlandı. Çalışmamamızda ısıtıcılı ceketli izole organ banyosu olarak May IOBS 99 ve beraberinde MAY WBC 3044 V3 ısıtıcı sirkülatör cihazı kullanıldı. İzole organ banyosuna asılı doku preparatlarının gerek çeşitli maddelere ve gerekse elektriksel alan stimülasyonuna verdiği yanıtların saptanmasında, izometrik tipte FDT 10- A Force Displacement Transducer'dan saptanan yanıtların amplifiye edilmesinde, BIOPAC Systems Inc. Amplifikatöründen yanıtların bilgisayar ortamına aktarılmasında ise BIOPAC Student Lab PRO Manual Professional Version 3.6.6 for PC with Windows programından faydalanıldı. Stimülatör olarak MAY ST 95 PT Stimülatör, güç kaynağı olarak da, MAY ISO 150 A Stimulus Isolated Power Supply cihazlarından yararlanıldı. Elektrodlar, 40 V gerilim altında, 1 saniye süreyle, 20 Hz frekanslı, 30 ms durasyonlu kare dalga formunda alan stimülasyonu oluşturacak şekilde ayarlanan stimülatöre bağlandı. Her bir uyarıdan sonra üç dakika dinlendirilen doku şeritlerine her seride üç uyarı uygulandı ve bu uyarılara verilen yanıtların ortalamaları elde edildi.

Kullanılan İlaçlar: Clonidine HCl (Sigma Co.), Yohimbine HCl (Sigma Co.), L-arginine (Sigma Co.), Nomega- Nitro-L-Arginine Methyl Ester Hydrochloride (LNAME) (Sigma Co.).

Tüm ilaçlar için deneyler öncesinde 1mM'lık stok solüsyonlar hazırlandı. Kullanılmayan stok solüsyonlar derin dondurucuda muhafaza edilirken, bunlardan hazırlanan dilüe solüsyonlar buzdolabında +4ºC'de saklandı. Stok solüsyonlar ve bunlardan hazırlanan konsantrasyonlar tüpleriyle birlikte haftada bir yenilendi.

Solvent olarak kullanılan distile su temininde AutostillTM, Jencons Scientific Lim. Cherrycourt Way Industrial Estate cihazı kullanıldı.

Veri analizi: İlaç uygulaması öncesinde 1 g'lık gerilim uygulanan sıçan ileum preparatlarının yohimbin, L-Arg, L-NAME ile ve bunların çeşitli kombinasyonlarının bulundurulduğu ve hiçbirinin bulundurulmadığı ortamda klonidinin farklı derişimlerinde elektriksel alan stimülasyonu ile elde edilen kasılma yanıtları BIOPAC Student Lab PRO MPV 3.6.6 fo PC programında ‘peak to peak' değerleri hesaplanarak gram (g) cinsinden ifade edildi.

Elektriksel alan stimülasyonu ile elde edilen kasılma yanıtları üzerine klonidinin inhibitör etki gücünü göstermek amacıyla IC50 ve –log IC50 (PD2) değerleri Graph Pad Prism Version 4.00 (Trial) for Windows, San Diego, USA programı kullanılarak non-lineer regresyon analizi ile hesaplandı. Bütün veriler ortalama±ortalamanın standart hatası (SH) şeklinde tanımlandı. Verilerin değerlendirilmesinde eşleştirilmiş Student's t testi ve One-way varyans analizi (ANOVA) kullanıldı; p< 0,05 ise gruplar arasındaki farkın anlamlı olduğu kabul edildi.

Ortama klonidin ilave edildiği zaman kontrol yanıtları olarak kabul ettiğimiz EFS yanıtlarına göre kasılma yanıtlarında doza bağımlı bir azalma meydana geldi. Klonidininin 10-8 derişiminde elde edilen kasılma yanıtları % 87±2,7, 10-7 derişimde % 75,8±4,2, 10-6 derişimde % 67,3±3,7, 10-5 derişimde ise % 55,3±1,8 olarak değişmiştir (n=6) (p<0,05) (Şekil 1). Ortama a2- adrenoseptör antagonisti yohimbinin ilave edilmesi ile klonidininin 10-8 derişiminde elde edilen kasılma yanıtları % 103,6±4,9, 10-7 derişimde % 96,4±5,3, 10-6 derişimde % 87,4±4,1, 10-5 derişimde ise % 81,7±5,2 olarak gözlenmiştir. Klonidin tarafından oluşturulan bu inhibisyon yohimbinin tarafından baskılanmıştır (n=6) (p<0,05) (Şekil 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Klonidin (10-8-10-5M) ve Yohimbin (10-6м)+ Klonidin(10-8-10-5M) grupları arasında belirgin farklılık gözlenmiştir (n=6) (p>0,05).

Nitrik oksit aracılı gevşeme yanıtları üzerine olası katkısının incelenmesi amacıyla ortama ilave edilen NO prekürsörü L-Arg, klonidinin EFS ile indükte kasılma yanıtları üzerine olan inhibitör etkinliğini artırdığı gözlenmiştir. Klonidininin 10-8 derişiminde elde edilen kasılma yanıtları % 68,6±1,3, 10-7 derişimde % 57,3±3,1, 10-6 derişimde % 48±0,7, 10-5 derişimde ise % 40,7±2,6 olarak değişmiştir (n=6) (p<0,05) (Şekil 2) ve benzer olarak kurgulanmış farklı seride ortama yohimbin ilave edilmesi durumunda kasılma yanıtlarının anlamlı olarak azaldığı gözlenmiştir. Bu şartlarda klonidinin 10-8 derişiminde elde edilen kasılma yanıtları % 92,5±3,7, 10- 7 derişimde % 86,9±4,2, 10-6 derişimde % 70,7±3,5, 10- 5 derişimde ise % 56,8±2,3 olarak değişmiştir (n=6) (p<0,05)(Şekil 2). Kasılma yanıtları üzerine inhibitör etkinliğinin sadece L-Arg bulundurulan gruba göre anlamlı şekilde azaldığı görüldü (p<0,05)(Şekil 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: EFS+L-Arjinin(10-6м)+Klonidin(10-8-10-5M) ve EFS+LArjinin( 10-6м) +Yohimbin(10-6м)+ Klonidin(10-8-10-5M) grupları arasında belirgin farklılık gözlendi (n=6) (p<0,05).

Nitrik oksit sentaz inhibitörü L-NAME bulundurulduğu ortama ilave edilen klonidin kümülatif dozlarında EFS'a verilen kasılma yanıtları klonidinin 10-8 derişiminde % 100,7±2,4, 10-7 derişimde % 96,2±2,1, 10-6 derişimde % 83,4±3,9, 10-5 derişimde ise % 77,5±1,2 olarak değişmiştir ancak bu yanıtlar arasında anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir (n=6)(p>0,05)(Şekil 3). Ortamda yohimbin ve L-NAME'in birlikte bulundurulduğu halde kasılma yanıtları klonidinin 10-8 derişiminde % 100±4,7, 10-7 derişimde % 99,4±3,2, 10-6 derişimde % 96,1±2,7, 10-5 derişimde ise % 93,1±4,1 olarak değişmiş ve yanıtlar arasında anlamlı farklılık gözlenmiştir (n=6) (p<0,05)(Şekil 3). Ortamda yohimbin bulundurulduğu halde EFS kasılma yanıtları üzerine inhibitör etkinliğinin sadece L-NAME bulundurulan gruba göre anlamlı şekilde azaldığı görülmüştür (p<0,05)(Şekil 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: EFS+L-NAME(10-6м)+Klonidin(10-8-10-5M) ve EFS+L-NAME(10-6м) + Yohimbin(10-6м)+Klonidin(10-8-10-5M) grupları arasında belirgin farklılık gözlendi (p<0,05).

Klonidinin EFS'a verdiği kasılma yanıtları ortama LArg ilave edildiği durumda belirgin olarak azalırken (p<0,05)(Şekil 4), L-NAME bulundurulan seride anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (p<0,05)(Şekil 4).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: EFS+Klonidin (10-8-10-5M), EFS+ L-Arjinin (10-6 м)+ Klonidin (10-8-10-5M), EFS+L-NAME(10-6 м)+Klonidin (10-8-10-5M) grupları arasında belirgin farklılık gözlenmiştir (n=6) (p<0,05).

Klonidinin ortamda yohimbin bulunduğu halde EFS'a verdiği kasılma yanıtları farklı serilerde ortamda L-Arg bulundurulduğunda belirgin bir inhibisyona neden olurken ortamda L-NAME bulunduğu halde anlamlı bir farklılık ile karşılaşılmamıştır (p>0,05)(Şekil 5). Ancak ortamda LArg ve yohimbin bulundurulduğu durumda klonidinin kümülatif derişimlerinde kasılma yanıtlarında inhibisyon görülürken, L-NAME+ yohimbin bulundurulduğu durumlarda kasılma yanıtları üzerine olan inhibisyonda düşüş kaydedilmiştir (p<0,05)(Şekil 5). Bu üç grup karşılaştırıldığı zaman aralarında anlamlı farklılık ile karşılaşılmıştır(p<0,05)(Şekil 5).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 5: Yohimbin(10-6м)+Klonidin(10-8-10-5M), L-Arg(10-6м)+Yohimbin(10-6 м)+Klonidin (10-8-10-5M) ve L-NAME(10-6 м)+Yohimbin(10-6 м)+Klonidin(10-8-10-5M) grupları kasılma yanıtları arasında anlamlı farklılıklar gözlendi (n=6) (p<0,05).

Elektriksel alan stimülasyonu ile elde edilen kasılma yanıtları üzerine klonidinin inhibitör etki gücünü göstermek amacıyla saptanan IC50 değerleri aşağıda gösterilmiştir (Tablo 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Gruplar arasında IC50 değerleri açısından farklılık gözlendi. Gruplar ve ortalama -log IC50 değerleri (n=6) (p<0,05).

NO veya benzeri bir yapının EFS ile uyarılmış NANK inhibitör yanıtlarının mediyatörü olduğu gösterilmiştir²⁵. Bu gözlem NO üretiminin Nitrik Oksit Sentaz aracılığı ile NO üretimi kalıbına dayanan L-argininin etkisinin LNAME tarafından geri çevrilmesi ile desteklenmektedir ^26,27.

Klonidin çeşitli bölgelerde nitrik oksiti indükleyerek etkilerini meydana getirmekte ve hatta birçok yerde etkinlik gösterebilmesi açısından nitrik oksite ihtiyaç duymaktadır. Bu konu üzerinde yapılan çeşitli çalışmalar klonidin ve nitrik oksitin çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda muhtemelen birbirlerinin etkileri üzerinde mediyatör rol oynayabileceğini göstermektedir ^28,29,30,31.

Çalışmamızda klonidinin elektriksel olarak uyarılan ileum kasılma yanıtları üzerine inhibitör rol oynadığı ve farklı serilerde ortama ilave edilen α 2-adrenoseptör blokörü yohimbinin inhibitör etkinlikte azalmaya neden olduğu görülmüştür. Elde edilen bulgular benzer bir çalışma ile desteklenmektedir ¹⁸

NO sentaz pozitif nöronlar intramural pleksuslarda bulunmakta ve NO gastrointestinal dokularda inhibitör nörotransmitter olarak önemli rol oynamaktadır ^32,33.

Klonidinin hidrofobik heterosiklik nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörleri ile yapısal benzerlik gösterdiği, farklı yapılarda nitrik oksit sentaz tip I'i selektif olarak inhibe ettiği, NOS II aracılı nitrik oksit üretimini artırdığı ve ²⁰ NOS II ekspresyonunun artışının ileum kontraktilitesinde azalmaya neden olabileceği gösterilmiştir ²¹. Benzer şekilde çalışmamızda, klonidinin kümülatif derişimlerinde EFS'a verilen kasılma yanıtlarındaki inhibisyon ortama ilave edilen L-arjinin tarafından potansiyalize edilmiş ve farklı seride benzer ortama ilave edilen yohimbin bu inhibitör etkiyi azaltmıştır ²⁷.

L-NAME'in in vivo olarak uygulanmasının klonidinin etkisini azalttığı gösterilmiştir ^19, ancak çalışmamızda ortama nitrik oksit sentaz inhibitörü L-NAME ilave edilmesi durumunda klonidinin kasılma yanıtları üzerine etki etmediği gözlenmiştir. Benzer şekilde intestinal peristaltizm üzerinde klonidinin etkisinin araştırıldığı bir çalışmada klonidin tarafından oluşturulan inhibisyonun LNAME tarafından engellenemediği gösterilmiştir ²⁴.

Bu konuda yapılan çalışmaların yetersizliği nedeniyle klonidin ve nitrik oksitin ileum düz kas kontraktil aktivitesi üzerine yaptıkları inhibisyonun mekanizması bilinmemektedir.

Sonuç olarak klonidinin elektriksel olarak uyarılmış kasılma yanıtlarını inhibe etmesi ve bu inhibisyonun yohimbin tarafından bozulması, L-arjininin klonidin aracılı gevşeme yanıtlarını potansiyelize etmesi ancak bu güçlü inhibisyonun L-NAME tarafından değil ama yohimbin tarafından bozulması, ancak ortamda L-NAME ve α2- adrenoseptör blokörü yohimbinin bulundurulduğu halde inhibisyonun yohimbinin tek başına uygulandığı gruba göre belirgin olarak azalması; NO ve klonidinin sıçan ileumunda gevşeme yanıtları üzerinde muhtemel bir etkileşim içersinde olabileceklerini göstermektedir.

Çalışmamızda, bulgularımızın istatistiksel değerlendirmelerinde değerli katkılarını esirgemeyen Prof. Dr. Yusuf Çelik'e teşekkür ederiz.

1) Van der Hulst RR, von Meyenfeldt MF, van Kreel BK, et al. Gut permeability, intestinal morphology, and nutritional depletion. Nutrition 1998; 14:1–6.

2) Kompan L, Kremzar B, Gadzijev E, et al. Effects of early enteral nutrition on intestinal permeability and the development of multiple organ failure after multiple injury. Intensive Care Med 1999; 25:157–61.

3) Kamibayashi T, Maze M: Clinical uses of 2-adrenergic agonists. Anesthesiology 2000; 93:1345–9.

4) Hall JE, Uhrich TD, Barney JA, et al. Sedative, amnestic, and analgesic properties of small-dose dexmedetomidine infusions. Anesth Analg 2000; 90:699–705.

5) Stieger DS, Cantieni R, Frutiger A. Acute colonic pseudoobstruction (Ogilvie's syndrome) in two patients receiving high dose clonidine for delirium tremens. Intensive Care Medicine 1997; 23(7):780-782.

6) Goyal RK and Hirano I. Mechanisms of disease: The enteric nervous system. N Engl J Med 1996; 334:1106- 1115.

7) Johnson LR, Alpers DH, Christensen J, et al. Physiology of the Gastrointestinal Tract (3rd ed.), Raven Press, New York, 1994: 751-794.

8) Shibata C, Balsiger BM, Anding WJ and Sarr MG. Adrenergic denervation hypersensitivity in ileal circular smooth muscle after small bowel transplantation in rats. Dig Dis Sci 1997; 42:2213–2221.

9) Ohtani N, Balsiger BM, Anding WJ, et al. Small bowel transplantation induces adrenergic hypersensitivity in ileal longitudinal smooth muscle in rats. J Gastrointest Surg 2000; 4:77-85.

10) Nishizaki K, Nakao K, Ishii H, et al. Induction of neuronal nitric oxide synthase by sympathetic denervation is mediated via a2-adrenoceptors in the jejunal myenteric plexus. Brain Research 2003; 965:121-129.

11) Langer SZ. 25 Years since the discovery of presynaptic receptors: present knowledge and future perspectives. Trends Pharmacol Sci 1997; 18:95-99.

12) Puig MM, Warner W, Pol O: Intestinal inflammation and morphine tolerance alter the interaction between morphine and clonidine on gastrointestinal transit in mice. Anesthesiology 2000; 93:219-30.

13) Bauer GE, Hellestrand KJ: Pseudo-obstruction due to clonidine (shortreport). BMJ 1976; 1:769.

14) Bredt DS, Hwang PM, Snyder SH. Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide. Nature 1990; 347:768-770.

15) Aimi Y, Kimura H, Kinoshita T, et al. Vincent, Histochemical localization of nitric oxide synthase in rat enteric nervous system. Neuroscience 1993; 53:553-560.

16) Nakao K, Takahashi T, Utsunomiya J and Owyang C. Extrinsic neural control of nitric oxide synthase expression in the myenteric plexus of rat jejunum. J Physiol 1998; 507:549-560.

17) Takahashi T. Pathophysiological significance of neuronal nitric oxide synthase in the gastrointestinal tract. J Gastroenterol 2003; 38(5):421-30.

18) Chahl LA. The properties of the clonidine withdrawal response of guinea-pig isolated ileum. Br J Pharmacol 1985; 85(2):457-62.

19) Shadpour D et al. Alpha-2-adrenoceptor hyporesponsiveness in isolated tissues of cholestatic animals: involvement of opioid and nitric oxide systems. Life Sciences 2003; 73(2):209-220.

20) Venturini G, Colasanti M, Persichini T, et al. Selective inhibition of nitric oxide synthase type I by clonidine, an anti-hypertensive drug. Biochemical Pharmacology 2000; 60(4):539-544.

21) Weisbrodt NW, Pressley TA, Li YF, et al. Decreased ileal muscle contractility and increased NOS II expression induced by lipopolysaccharide. Am J Physiol 1996; 271(3)454-60.

22) Shebuski RJ and Zimmerman BG. Prejunctional alpha 2- adrenoceptor mediated inhibitory action of clonidine and BHT 920, but not urapidil in guinea pig ileum. Experimental Biology and Medicine 1985; 178:133-138.

23) Stebbing MJ, Johnson PJ, Vremec MA and Bornstein JC. Role of á 2-adrenoceptors in the sympathetic inhibition of motility reflexes of guinea-pig ileum. Journal of Physiology 2001; 534(2)465-478.

24) Herbert MK, Goldbrunner SR, Holzer, Roewer N. Clonidine and Dexmedetomidine Potently Inhibit Peristalsis in the Guinea Pig Ileum In Vitro Anesthesiology 2002; 97:1491- 9.

25) Todorov S, Pozzoli C, Zamfirova R & Poli E. Prejunctional modulation of non-adrenergic non-cholinergic (NANC) inhibitory responses in the isolated guinea-pig gastric fundus. Neurogastroenterology and Motility 2003; 15:299-301

26) Desai KM, Warner TD, Bishop AE, Polak JM, Vane JR. Nitric oxide, and not vasoactive intestinal peptide, as the main neurotransmitter of the vagally induced relaxation of the guinea pig stomach. Br J Pharmacol 1994; 113:1197–202

27) Boeckxstaens GE, De Man JG, Pelckmans PA, Herman AG, Van Maercke YM. Alpha 2-adrenoceptor-mediated modulation of the nitrergic innervation of the canine isolated ileocolonic junction. Br J Pharmacol 1993; 109:1079–84.

28) Figueroa XF, Poblete MI, Boric MP, et al. Clonidineinduced nitric oxide-dependent vasorelaxation mediated by endothelial α 2-adrenoceptor activation. British Journal of Pharmacology 2001; 134, 957−968.

29) Xu Z, Chen SR, Eisenach J, Pan HL. Role of spinal muscarinic and nicotinic receptors in clonidine-induced nitric oxide release in a rat model of neuropathic pain. Brain Res 2000; 861(2):390-8.

30) Dobrucki LW, Cabrera CL, Bohr DF, Malinski T. Central hypotensive action of clonidine requires nitric oxide. Circulation 2001; 104:1884-1886.

31) Moura RS, Rios AAS, de Oliveira LF, et al. The Effects of Nitric Oxide Synthase Inhibitors on the Sedative Effect of Clonidine. Anesth Analg 2001; 93:1217-1221.

32) Bayguinov O, Keef KD, Hagen B, Sanders KM. Parallel pathways mediate inhibitory effects of vasoactive intestinal polypeptide and nitric oxide in canine fundus. Br J Pharmacol 1999; 126: 1543-52, 1999.

33) Williams SJ, Parson ME. Evidence for a role for nitric oxide in relation of the frog oesophageal body to electrical field stimulation. Br J Pharmacol 1997; 122: 179–85.

34) Storr M, Gaffal E, Schusdziarra V, Allescher HD. Endomorphins 1 and 2 reduce relaxant non-adrenergic, non-cholinergic neurotransmission in rat gastric fundus. Life Sci 2002; 71: 383–9.