Dondurma öncesi sperm hücrelerinin manipülasyonu veya dondurma-çözme işlemleri, hücrelerin zona pellüsida penetrasyon yeteneklerini etkilememektedir^2,3. Aksine bu sayede gebelik başarısında önemli olan ileri doğru hareketli sperm hücreleri seçilerek örnekler optimize edilebilmektedir⁴. Sperm yıkama işleminde sıklıkla dansite-gradient, swim-up ve yıkama-santrifüj teknikleri kullanılmakta olup her hangi birinin diğerlerine üstünlüğü henüz kanıtlanamamıştır⁵.

Sperm hareketlilik ve canlılık oranları yardımcı üreme teknikleri tedavisinde gebelik oranlarını etkilemektedir^6,7. Dondurma işlemi sonucu sperm hücrelerinin hareketlilik ve canlılık oranları azalmaktadır⁸. Dondurma-çözme sonrası elde edilen sperm örneklerinin kaliteleri değişkenlik göstermektedir⁹.

Bu çalışmada ham halde ve dansite-gradient yöntemleriyle dondurulmuş sperm örneklerinin çözülme sonrası canlılık ve apoptozis oranlarının akım sitometrisi yöntemiyle karşılaştırılması amaçlanmıştır.

Akım sitometrisi sonuçlarına göre yıkanmadan dondurulan örneklerin canlı, apoptotik ve ölü hücre oranları sırasıyla % 40.27±10.91, 17.82±15.45 ve 41.91±19.76 olarak hesaplandı. Dondurulmadan önce gradient yöntemiyle yıkanmış örneklerin akım sitometrisi sonuçları canlı % 48.41±14.64, apoptotik % 2.31±2.75, ölü % 49.27±15.71 olarak ölçüldü.

Ölü hücre oranları arasında dondurulmadan önce yıkanmış ve yıkanmamış örnekler arasında önemli fark saptanmadı (n=12, t=-2.012, p=0.072). Dondurulmadan önce yıkanmış örneklerde diğer gruba kıyasla canlı hücre oranı daha yüksek (t=3.744, p=0.004), apoptotik hücre oranı ise daha düşük (t=-3.860, p=0.003) olarak hesaplandı (Tablo 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Sperm dondurma çözme işlemi öncesi 12 sağlıklı gönüllüden alınan örneklerin dansite gradient yöntemiyle yıkanmış ve yıkanmamış kısımlarının, çözme işlemi sonrası akım sitometrisi analizi sonuçlarının karşılaştırılması (n=12, paired t test, veriler ortalama standart sapma olarak verilmiştir).

Yardımcı üreme tekniklerinde, özellikle artifisyel inseminasyon işleminde infertil erkeklerde düşük oranda olan hızlı hareketli sperm oranlarının arttırılması hedeflenmektedir. Bu hastaların seminal plazmalarında normalden daha yüksek oranlarda serbest oksijen radikalleri bulunmakta olup, bu hastalara anti-oksidan tedavi verilmesinin teorik olarak oksidatif hasarı azaltacağı kabul edilmektedir¹¹. Serbest oksijen radikalleri sperm motilite, sağ kalım ve fonksiyonlarını membran lipid, protein ve DNA yapısını bozarak etkilemektedir^12-16. Normal şartlar altında invivo anti-oksidan yolaklar oksidatif hasara karşı yeterli korumayı sağlarken¹⁷ yardımcı üreme tekniklerinde kullanılan medyumlara anti-oksidan eklenmesine rağmen sperm hasarının önüne geçilememektedir. Bu çalışmada da sağlıklı deneklerden alınan dondurma-çözme işlemi sonrasında canlı hücre oranları on yıkama yapılmış ve yapılmamış örneklerde % 48.81 ve 40.27 olarak ölçülmüştür.

Programlı hücre olumu olarak bilinen apoptozis, sperm hücrelerinde DNA hasarı tarafından artırılmaktadır¹⁸. Apoptozis infertiliteye yol açmaktadır¹⁹. İnfertil hasta populasyonunda da apoptozis kontrollere göre daha yüksek oranda izlenmektedir²⁰. Standart spermiogram parametreleri apoptozis düzeyini tam olarak yansıtmayabilir fakat apoptozis erkek infertilitesinde muhtemelen rol oynayan bağımsız bir fenomen olarak kabul edilmektedir¹¹. Bu çalışmada on yıkama yapılan örneklerde apoptotik hücre oranı % 2.31, yıkanmamış örneklerde % 17.82 olarak ölçülmüştür. Bu sonuca ilk grupta yıkama işlemiyle sağlıklı hücrelerin seçilmiş olması yol açmış olabilir.

Erkek infertilitesinde immatür germ hücreleri, bakteriyel kontaminasyon ve enfeksiyon gibi sebepler seminal plazmada oksidatif stresi arttırmaktadır¹¹. Yıkama işlemi sonrasında bu etkenler uzaklaştırılmakta ve seçilmiş hücreler konsantre edilebilmektedir fakat santrifuj işleminin yarattığı hasar önlenememektedir. Sperm dondurma-çözme işlemleri de membran ve DNA hasarını arttırmaktadır. Dondurma işlemi esnasında seminal plazmanın kriyoprotektan etkisi sperm dondurma medyumlarinda albumin ve antioksidan katkılarıyla kısmen sağlanmaktadır¹¹. Bu çalışmada sağlıklı örneklerde dondurma öncesi gradient yöntemiyle sperm hazırlanmasının çözme sonrası sperm parametrelerini olumlu etkilediği tespit edilmiştir. Bu yöntemin özellikle sperm konsantrasyonu düşük infertil hastalarda hem oksidatif stresi arttıran etkenlerden temizlenmesi hem de konsantrasyonun arttırılması sayesinde daha etkili olacaktır. Sağlıklı örneklerde ise daha kolay ve ucuz bir yöntem olan yıkamasız dondurma tekniği tercih edilebilir.

1) Yogev L, Kleiman S, Shabtai E, et al. Seasonal variations in pre- and post-thaw donor sperm quality. Hum Reprod 2004; 19: 880-885.

2) Gamzu R, Yogev L, Yavetz H, et al. Fresh and frozen±thawed human sperm bind in a similar pattern to the zona pellucida in the hemizona assay. Fertil Steril 1992; 58: 1254-1256.

3) Yogev L, Gamzu R, Paz G, et al. Pre-freezing sperm preparation does not impair thawed spermatozoa binding to the zona pellucida. Hum Reprod 1999; 14: 114-117.

4) Tomlinson ML, Kessopoulou E, Barratt CLR. The diagnostic and prognostic value of traditional semen parameters. J Androl 1999; 20: 588-593.

5) Boomsma CM, Heineman MJ, Cohlen BJ, Farquhar C. Semen preparation techniques for intrauterine insemination. Cochrane Database Syst Rev 2007; 17: CD004507.

6) Mahadevan MM, Tounson AO, Milne BJ, Leeton JF. Influence of semen and donor factors on the success rate of artificial insemination with frozen semen. Clin Reprod Fertil 1982; 1: 185-193.

7) Johnston RC, Kovacs GT, Lording DH, Baker HWG. Correlation of semen variables and pregnancy rates for donor insemination: A 15-year retrospective. Fertil Steril 1994; 61: 355-359.

8) Sharma RK, Vemulapalli S, Kohn S, Agarwal A. Effect of centrifuge speed, refrigeration medium, and sperm washing medium on cryopreserved sperm quality after thawing. Arch Androl 1997; 39: 33-38.

9) Kolon TF, Philips KA, Buch JP. Custom cryopreservation of human semen. Fertil Steril 1992; 58: 1020-1023.

10) Kliesch S, Cooper TG. Semen analysis: spermiogram according to WHO criteria. Urologe A. 2008; 47: 1548-1554.

11) Sicca SC. Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Andrology and Assisted Reproductive Technology 2004; 25: 5-17.

12) Aitken RJ, Clarkson JS. Cellular basis of defective sperm function and its association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa. J Reprod Fertil1987; 81: 459-469.

13) Alvarez JG, Touchstone JC, Blasco L, Storey BT. Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. J Androl 1987; 8: 338-348.

14) Gagnon C, Iwasaki A, de Lamirande E, Kovalski N. Reactive oxygen species and human spermatozoa. Ann N Y Acad Sci 1991; 637: 436-444.

15) Hellstrom WJG, Bell M, Wang R, Sikka SC. Effect of sodium nitroprusside on sperm motility, viability and lipid peroxidation. Fertil Steril 1994; 61: 1117-1122.

16) Aman RP, Shabanowitz RB, Huszar G, Broder SJ. Populations of human sperm or damage to sperm resulting from cryopreservation. Journal of Andrology 1999; 20: 649-654.

17) Jones R, Mann T, Sherins RJ. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa: spermicidal effects of fatty acid peroxides and protective action of seminal plasma. Fertil Steril. 1979; 31: 531-537.

18) Sinha-Hikim AP, Swerdloff RS. Hormonal and genetic control of germcell apoptosis in the testis. Rev Reprod 1999; 4: 38-47.

19) Sun JG, Jurisicova A, Casper RF. Detection of deoxyribonucleic acid fragmentation in human sperm: correlation with fertilization in vitro. Biol Reprod 1997; 56: 602-607.

20) Sakkas D, Moffatt O, Manicardi G, et al. Nature of DNA damage in ejaculated human spermatozoa and possible involvement of apoptosis. Biol Reprod 2002; 66: 1061-1067.