Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada TTV DNA pozitif hasta örneklerinden ORF2b gen kısmı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltıldı ve pGEM®-T plasmid vektörde klonlandı.

Bulgular: ORF2b genleri bulunduran rekombinant vektörler restriksiyon enzim analizi ve PCR-tarama testleri ile belirlendi.

Sonuç: TTV'nin genlerin klonlanması ülkemizde viral gen kütüphanelerinin zenginleşmesini sağlayacaktır. Ayrıca, gelecek çalışmalarda bu rekombinant plasmidlerle açıklatılacak hedef proteinler ELISA kitlerinin geliştirilmesinde kullanıla bilinecektir.

Transfusion-transmitted virus ilk olarak 1997 yılında kan transfüzyonu yapılan hepatitis hastalarında belirlenmiş ve bu nedenle de yeni bir posttransfüzyon hepatit etkeni olarak tanımlanmıştır¹. Daha sonraki çalışmalarda bu virusun bir çok ülkede, hepatitli hastalara ilave olarak sağlıklı bireylerde de yüksek prevalansı tespit edilmiştir. Ancak, karaciğer hastalarında oldukça yüksek pevalansı sebebiyle, bu virus varlığı ile hepatitler arasında ilişki olacağı kanısı güçlenmiştir^2,6.

Moleküler biyoloji alanında, özellikle biyolojik ve fonksiyonel olarak önem arz eden bir gen bölgelerinin genetik klonları, hedef gen bölgesinin uzun süreli saklanması, daha sonraki aşamalarda dizilimlerinin çıkartılması ve ökaryotik veya prokaryotik sistemlerde açıklatılması amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır^7,8. Ayrıca, protein-gen ilişkisinin aydınlatılması için klonlanan gen bölgesinde nokta mutasyonları yaparak reverse genetik çalışmaları yapılabilmektedir. Genetik klonlamalar rekombinant DNA aşılamaları geliştirilmesi için de başlangıç aşamasıdır⁹.

Bu çalışmada, TTV genomunun üç açık okuma bölgesinden (ORF) biri olan ORF2b gen bölgesinin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılması ve daha sonra çoğaltılan bu gen bölgelerinin genetik klonlanması amaçlanmıştır.

İnzört Geninin Çoğaltılması: Spesifik primerler, TTV pozitif serumlardan elde edilen DNA örnekleri ve GoTaq® DNA polimeraz enzimi (Promega Co., USA) kullanılarak yaklaşık 580 baz çift (bç) uzunlukta inzört DNA’lar PCR ile sentez edildi. Bu çalışmada TTV’nin ORF2b bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan primerler (ORF2b F; 5’-ATGGGCAAGGCTCTTAG-3’ ve R; 5’- TTACTCGTCTGCCTCGATAGCGG -3’) gen bankasında BLAST programında seçildi.

Polimeraz zinciri reaksiyonu ile çoğaltılan 580 baz çifti (bç) uzunluktaki gen bölgesi (amplikon) %1’lik low-melting agaroz jelde, ultraviole ışık kaynağı altında steril bistüri ile kesilerek mikrosantrifüj tüpü içerisine alındı. Jeldeki uzaklaştırılan DNA’lar Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, USA) ile temiz ürünler olarak elde edildi. Elde edilen DNA’ların konsantrasyonları spektrofotometrede ölçülerek kullanılıncaya kadar insertler -80 °C’de muhafaza edildi¹¹.

pGEM®-T Plazmide Klonlama: Amplifiye edilen gen ürünleri pGEM®-T (pGEM®-T Easy Vector Systems plazmid vektörü içinde, üretici firmanın (Promega Co., USA) önerileri doğrultusunda klonlandı. Kısaca, pürifiye edilen amplikonlar pGEM®-T vektöre 2X Rapid Ligation Buffer ve T4 DNA Ligase enziminin olduğu ortamda yerleştirildi. Ligasyonu yapılan bu plazmid DNA’ların transformasyonları soğuk CaCl2 içeren ortamda high-efficiency competent E. coli DH5α hücrelerine gerçekleştirildi. Transforme hücreler ampisilin 100 μg/mL içeren LB agar pleytlerinde üretildi. Klonlama işlemini takiben rekombinant plasmid vektörlerin belirlenmesi β-galactosidase bağlı mavi-beyaz koloni seçim yöntemine ilave olarak PCR tarama metodu (PCR screening method) ve BstZI restriksiyon enzim kesmi kullanılarak doğrulandı¹².

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: PCR ile çoğaltılan yaklaşık 580 baz çifti uzunluğundaki ORF2b gen bölgesinin % 1’lik agarose jelde görüntüsü. M; 100 baz çifti DNA marker, Hat 1, 2 ve 4; Serum örneklerde çoğaltılan ORF2b gen bölgesi, Hat 3; TTV negatif serum örneği.

İnzört hedef gen içermeyen pGEM®-T vektör DNA’ları (Şekil-2, Hat 1) ve inzört gen içeren rekombinant vektör DNA’ları % 0.75’lik agarose jelde yürütüldü (Şekil-2, Hat 2). Ayrıca, rekombinant pGEM®-T vektör içinde spesifik gen bölgelerinin varlığının doğrulanması restriksiyon enzim analiz (Şekil-2, Hat 3 ve 4) ve PCR tarama testi (Şekil-3) metotlarıyla gerçekleştirildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: Rekombinant vektörde TTV ORF bölgesinin varlığının BstZI restriksiyon enzim analizi metotlarıyla doğrulanması. Hat 1; pGEM®-T vektör, Hat 2; Rekombinant pGEM®-T vektör, Hat 3 ve; Hat 4; BstZI enzimi ile kesilen rekombinant pGEM®-T vektör.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: Rekombinant vektörde TTV ORF bölgesinin varlığının PCR-tarama testi ile doğrulanması. M; 100 baz çifti DNA marker, Hat 1-3; ORF2b geni pozitif rekombinant pGEM®-T plasmid vektörler.

Yaklaşık 3800 nükleotit uzunlukta olan TTV tam genomlarının analizi neticesinde virusun en az üç açık okuma bölgesine sahip (ORF) olduğu tespit edilmiştir. Bu ORF’lerden en uzunları ORF1’dir ve bu ORF virusun kapsid proteinlerini kodlamaktadır. Kısa olan ve non-yapısal proteinleri kodlayan ORF2 ise ORF2a ve ORF2b olarak isimlendirilen iki kısma ayrılmıştır^14-16. TTV N22 gen bölgesinin analizine göre TTV’nin en az 30 genotipi tespit edilmiştir¹⁶. ORF 2a gen bölgesi tüm genotipler arasında korunmuş iken ORF2b gen bölgesi oldukça değişkendir^14-16.

Gerek ORF2a ve gerekse ORF2b’ye karşı DNA pozitif bireylerde iyi immun yanıt şekillenmediği tespit edilmiştir. Bunun ise her iki proteinin virusun non-yapısal proteinleri olmasından kaynaklanabileceği düşünülmektedir^2,16. Daha önce yapılan çalışmalarda amaca uygun olarak TTV’nin ORF bölgeleri bireysel veya tam genom olarak farklı vektörlerde klonlanmıştır^14-16. Yaptığımız taramalarda ülkemizde TTV’nin ORF bölgelerinin klonlanmasına dair herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Sonuç olarak, mevcut çalışmada TTV’nin belirlenmiş üç ORF bölgesinden biri olan ORF2b’nin klonlanması gerçekleştirilmiştir. Diğer ORF bölgelerinin klonlanması, bunların da ORF2b ile birlikte sekanslatılması ve açıklatılması çalışmaları devam ettirilmektedir. Bu ve benzeri çalışmalar ülkemizde viral gen kütüphanelerinin zenginleşmesini sağlayacaktır. Ayrıca, gelecek çalışmalarda, uygun vektörlerde açıklatılacak hedef proteinlerle tanısal ELISA kitleri dizayn edilecektir.

1) Nishizawa T, Okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun 1997; 241: 92–97.

2) Bostan N, Amed N, Bokhari H. Current and future prospects of Torque teno virus. Vaccines & Vaccination 2013; 1: 1-9.

3) Kojima H, Kaita KD, Zhang M, Giulivi A, Minuk GY. Genomic analysis of a recently identified virus (SEN virus) and genotypes D and H by polymerase chain reaction. Antiviral Res 2003; 60: 27-33.

4) Inami T, Obara T, Moriyama M, Arakawa Y, Abe K. Full-length nucleotide sequence of a simian TT virus isolate obtained from a chimpanzee: Evidence for a new TT virus-like species. Virology 2000; 25: 330-335.

5) Iwaki Y, Aiba N, Tran HT, et al. Simian TT virus (s-TTV) infection in patients with liver diseases. Hepatol Res 2003; 25: 135-142.

6) Das K, Kar P, Gupta RK, Das BC. Role of transfusion-transmitted virus in acute viral hepatitis and fulminant hepatic failure of unknown etiology. J Gastroenterol Hepatol 2004; 19: 406-412.

7) Altshuler D, Daly MJ, Lander ES. Genetic mapping in human disease. Science 2008; 322: 881-888.

8) Zhou F, Gao SJ. Recent advances in cloning herpesviral genomes as infectious bacterial artificial chromosomes. Cell Cycle 2011; 10: 434-440.

9) Donati C, Rappuoli R. Reverse vaccinology in the 21st century: Improvements over the original design. Ann N Y Acad Sci 2013; 1285: 115-132.

10) Toroman ZA, Bulut Y, Özdarendeli A, Kalkan A. Kronik hepatit B ve C virüs infeksiyonlu olgularda transfusion transmitted virus (TTV) DNA’sının PZR ile belirlenmesi. Fırat Tıp Dergisi, 2003; 8: 153-155.

11) Bulut Y, Doymaz MZ. Hepatit B virus core antijeni (HBcAg) geninin Escherichia coli’de klonlanması. Mikrobiyol Bul 2001; 35: 127-132.

12) Bulut Y, Doymaz MZ. Hepatit B virüsü HBcAg geninin klonlanması ve ökaryotik hücrelerde eksprasyonu. Mikrobiyol Bul 2003; 35: 183-191.

13) Koidl C, Michael B, Berg J, et al. Detection of transfusion transmitted virus DNA by real-time PCR. J Clin Virol 2004; 29: 277-281.

14) Erker JC, Leary TP, Desai SM, Chalmers ML, Mushahwar IK. Analyses of TT virus full-length genomic sequences. J Gen Virol 1999; 80: 1743-1750.

15) Kamahora T, Hino S, Miyata H. Three spliced mRNAs of TT virus transcribed from a plasmid containing the entire genome in COS1 cells. J Gen Virol 2000; 74: 9980-9986.

16) Kakkola L, Hedman K, Vanrobaeys H, Hedman L, Söderlund-Venermo M. Cloning and sequencing of TT virus genotype 6 and expression of antigenic open reading frame 2 proteins. J Gen Virol 2002; 83: 979-990.