Gebe Sıçanlarda Oksitosinle İndüklenmiş Miyometriyum Kasılmaları Üzerine Nebivololün İnhibe Edici Etkisi

Bu çalışma, oksitosin ile indüklenen izole miyometriyum kasılmaları üzerine, seçici β1 blokör olan ve nitrik oksit (NO) aracılı etkileri bulunan nebivololün, etkilerinin araştırılması amacıyla yapıldı.

Çalışmada 10 adet 250-300 g ağırlığında erişkin Wistar cinsi dişi sıçan kullanıldı, östrus siklusları günlük vajinal smear bakılarak takip edildi. Smearlarında sperm görüldüğü gün, gebeliğin ilk günü olarak kabul edildi. Gebeliğin 16. günü sıçanlar servikal dislokasyonla öldürüldü. Uterus dokuları, fetal dokular ve plasentalarından ayrıldı. Krebs solüsyonuna alındı. 1x 0,2x 0,2 santimetre boyutlarında miyometriyum kesitleri hazırlandı. Myometriyum kesitleri Krebs solüsyonu içerisinde; %95 oksijen ve %5 karbondioksitle sürekli gazlandırılan PH 7,4 ve 37 ºC bulunan organ banyosuna alındı. 1 g istirahat gerilimi altında asılarak izometrik kontraksiyonlar kayıt edildi. Miyometriyum kesitlerinde 30 dakika süreyle spontan kasılmalar gözlendi. Ardından miyometriyum aktivitesi oksitosin hormonu uygulanarak anlamlı bir şekilde artırıldı. Daha sonra nebivololün farklı dozları (50, 250 ve 500 μM) uygulandı.

Uygulanan oksitosin sonrası, ortama ilave edilen 50, 250 ve 500 M nebivolol, ortalama frekans (f) ve ortalama eğri altında kalan alan (EKA)'da istatistiksel olarak anlamlı bir inhibisyon gerçekleştirdi. (p<0,05). Yalnız ortalama pik amplitüd (PA) üzerinde 50M nebivolol ilavesinden sonra istatistiksel olarak anlamlı bir fark oluşmadı. Ortalama PA'da 250 ve 500 µM nebivolol ilavesinden sonra istatistiksel olarak anlamlı bir inhibisyon gerçekleştirdi. (p<0,05).

Bir beta bloker olan nebivololün miyometriyum kontraksiyonları üzerinde inhibitör bir etkiye sahip olduğu tespit edildi.

This study was designed to determine the effect of nebivolol, which is a selective β1 blocker and has nitric oxide (NO) mediated effects, on oxytocin induced isolated myometrial contractions.

Ten adult Wistar female rats, weighting between 250-300 grams, were used in our study. Oestrus cycles were determined by taking vaginal smears everyday. The day when sperm was determined on smear was accepted as the first day of pregnancy. On 16th day of pregnancy, rats were killed by cervical dislocation. Placentas and fetal tissues were seperated from each uterus and placed in Krebs solutions. Myometrium strips measuring 1x 0,2x 0,2 cm. were prepared and placed in an organ bath containing krebs solution constantly bubbled with 95% oxygen, 5% carbon dioxide, at 37 ºC and pH 7,4. Under 1 gram of resting tension, isometric contractions were recorded. Spontaneous contractions were seen for 30 minutes and then myometrial activity was stimulated with oxytocin. After stimulation with oxytocin different doses of nebivolol (50,250 and 500 µM) were applied.

Addition of 50, 250 and 500 µM nebivolol showed statistically significant decrease on mean peak amplitude, mean frequency and mean area under curve (p<0,05 Wilcoxon Rank Test). But no statistically significant difference was determined on mean peak amplitude after addition of 50 µM nebivolol.

It was determined that nebivolol, a beta blocker, had an inhibitory effect on oxytocin-induced contractions of myometrium.

Introduction

Nitrik oksit (NO) aracılı bazı ek vazodilatatör etkilerle donatılmış, yüksek düzeyde seçici bir β1 blokör olan nebivolol ilk kez 1995 yılında Hollanda'da esansiyel hipertansiyon endikasyonu için ruhsat almış bir ajandır[1]. Kimyasal yapısına bakıldığında diğer β₁-blokörlerden ayrılır. Nebivolol molekülünün, bir nitrojen atomu etrafında bir C₂ simetri ekseniyle, 4 asimetrik karbon atomu vardır. Nebivolol, d-nebivolol (SRRR-OSR₃'lü dekstro-izomer konfigürasyonu) ile l-nebivolol (RSSS ORS₂ levo-izomer konfigürasyonu) enantiyomerlerinin eşit oranlı rasemik karışımıdır. Bu nedenle karışıma dl-nebivolol adı verilir (Şekil 1)[2].

Nebivololün damar düz kaslarına olan gevşetici etkisi NO ve cGMP bağlı mekanizmalarla olur[3]. Nebivolol çift etki mekanizmalı bir ajandır. Hem NO salınımını arttırarak, hemde β₁ adrenoreseptör antagonizmasıyla etki eder. Damar endotelinde NO aktivasyonuna neden olduğu kanıtlanmıştır.

Deneylerde nebivolol ile NG-monometil-L-Arjinin maddesinin (LNMMA), beraber kullanılması esnasında düz kas gevşemesinin bozulması, nebivoloün vazodilatasyonu endotelyal metabolik sistem L-arjinin/NO aktivasyonu ile yaptığını destekler. Çünkü L-NMMA bir NO sentez inhibitörüdür[4,5].Nebivololün endotelyum bağımlı vazodilatatör etkisi mikrosirkülasyon içinde geçerlidir[6].

NO vücuttaki tüm dokularda bulunur ve önemli işlevler yürütür. Uterin dokularda NO sentaz enziminin bulunması, miyometriyal kontraktilite ve plasental kan akımının düzenlenmesinde NO'nun rol aldığının bir göstergesidir[7]. NO'nun moleküler hedefleri arasında çözünebilir guanilat siklaz (çGS) ve adenozin difosfat (ADP)-ribozil transferaz yer alır. Guanilat siklaz aracılığı ile oluşan siklik guanozin monofosfat (cGMP), çeşitli protein kinazları, siklik nükleotid fosfodiesterazları, iyon kanallarını ve diğer bazı proteinleri etkiler.[8].

Klinik etkileri açısından bakıldığında nebivolol uygulanması kolay, tolerabilitesi yüksek bir ilaçtır. Yan etkileri oldukça az görülür. Başlıca yan etkileri bradikardi, baş dönmesi, baş ağrısı, asteni, taşikardi, çarpıntı, döküntü, ağız kuruluğu uykusuzluk, bulantı, parestezi, ekstremite ödemi ve anksiyetedir[9].

Bu çalışmada nebivololün damar düz kasları üzerine olan nitrik oksit aracılı gevşetici etkisinden yola çıkılarak uterus düz kasları üzerine olan etkilerinin incelenmesi amaçlanmış, gebe sıçan miyometriyumu üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

Material and Method

Bu çalışma lokal etik komite tarafından onaylanmasını takiben gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan 10 adet 250-300 g. ağırlığında erişkin Wistar cinsi dişi sıçan Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırmalar Merkezi (FÜTDAM)'dan temin edildi. Sıçanların östrus siklusları günlük vajinal smear bakılarak takip edildi. Östrus tespitinde sıçanlar, her kafeste dört dişi bir erkek olacak şekilde eşlenerek kafeslendikten sonra, vajinal smearlarında sperm görüldüğü gün gebeliğin ilk günü olarak kabul edildi. Gebeliğin 16. günü deneylere başlandı. Sıçanlar servikal dislokasyonla öldürüldü ve uterusları çıkarıldı. Uterus dokuları, fetal dokular ve plasentalarından ayrılarak içerisinde Krebs çözeltisi bulunan petri kutularına alındı. + dört santigrat derecede saklandı. Uterus üst kutuplarından 1x 0,2x 0,2 santimetre boyutlarında miyometriyum kesitleri hazırlandı. Her bir sıçan uterusundan bir adet kesit hazırlandı.

Kesitler içerisinde % 95 oksijen ve % 5 karbondioksitle sürekli gazlandırılan 37ºC'de Krebs solüsyonu bulunan termostatlı peristaltik pompa düzenekli ve çift çeperli izole organ banyosuna alındı. İstirahat şartlarını oluşturmak için kesitler, 1 gram istirahat gerimi altında asıldı ve izometrik kasılmalar kaydedildi. İzometrik kasılmalar “izometrik güç çevirgeci” (Harvard Apparatus Limited, Kent, İngiltere) ve arabirim ile osilografa (Harvard Apparatus Limited, Kent, İngiltere) aktarılarak yazdırıldı. Ölçüm ve değerlendirmeler bu kayıtlar üzerinde yapıldı.

Her bir sıçandan alınan kesitler, organ banyosunda 30 dakikalık uyum periyodunu takiben, sekiz adet kas 1 μM oksitosin (Synpitan Forte, Deva, İstanbul) ile indüklendi ve yine on beş dakika arayla ve sırasıyla 50, 250 ve 500 μM olacak şekilde nebivolol (Vazoxen, İbrahim&Ethem Ulagay, İstanbul) kümülatif olarak ilave edildi. Ortam pH'sı her uygulamayı takiben kontrol edildi. Oluşan etki kayıt altına alındı. İki adet kas spontan düzenli kasılma göstermediğinden çalışmaya dahil edilmedi.

Elde edilen sonuçların istatistiksel olarak değerlendirilmesinde Nonparametrik Wilcoxon Signed Ranks Testi ve gruplar arası farklılığı ortaya koymak için Mann Whitney-U Testi kullanıldı. p<0,05 değeri anlamlı kabul edildi. Hazırlanan grafikler ise Sigma Plot 80 programıyla oluşturuldu. Bütün istatistiksel değerlendirmeler SPSS 10.0 programı kullanılarak bilgisayar ortamında gerçekleştirildi.

Results

Çalışmada kullanılan on adet sıçandan alınan on adet uterus kas kesitinin sekiz tanesi spontan düzenli kasılma gösterdi. İki tanesi spontan düzenli kasılma göstermediğinden değerlendirmeye alınmadı. Sekiz adet preparata 1µM oksitosin uygulandıktan sonra düzenli kasılmalar elde edildi. Yirmi dakikalık düzenli kasılmadan sonra ortama 50µM nebivolol eklendi ve sonrasında on beş dakikalık kasılma kaydedildi. Oksitosin sonrası PA: 3058±97,8 g, f: 10,4±0,5 /15 dk. ve EKA: 1587±94 idi. 50 µM nebivolol uygulandıktan sonra ortalama PA: 2746±89 g, ortalama f: 8,1±0,5 /15 dk. ve EKA: 1033±95 olarak bulundu.

Ardından ortama 250 µM nebivolol ilave edildi. On beş dakika kayıt alındı Bu ilave işlemiyle birlikte ortalama PA: 1191±84,7 g., ortalama f: 5,0±0,4 /15 dk. ve EKA: 126±75 olarak bulundu. Yine son aşamada ortama bu defa 500µM nebivolol ilave edildi ve on beş dakika kayıt alındı. Ortalama PA: 427±54 g. ve f: 3,8±0,6 /15 dk. ve EKA: 45±25 olarak bulundu. Nebivolol deney aşamaları esnasında kümülatif olarak uygulandı.(Şekil 2, 3, 4)

Bu gurupta uygulanan oksitosin sonrası, ortama ilave edilen 50, 250 ve 500 µM nebivolol, ortalama f ve EKA'da istatistiksel olarak anlamlı bir inhibisyon gerçekleştirdi. (p<0,05 Wilcoxon Rank Test). Ortalama PA'da 250 ve 500 µM nebivolol dozlarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark oluşurken, ortalama PA'da 50µM nebivolol ilavesinden sonra istatistiksel olarak anlamlı bir fark oluşmadı. (Tablo 1)

Discussion

Yaptığımız çalışmada, ilk kez 1995 yılında Hollanda da esansiyel hipertansiyon tedavisinde kullanılmak üzere ruhsat almış, yüksek düzeyde seçici bir β₁ blokör olan nebivololün oksitosin ile indüklenmiş gebe rat miyometriyumundaki kasılmalar üzerine olan etkileri incelendi. Nebivolol; oksitosin hormonuyla indüklenmiş olan kasılmaların pik amplitüdünü ve eğri altında kalan alanı doza bağımlı olarak baskıladı. Kasılmaların frekanslarında ise tüm nebivolol dozlarında istatistiksel olarak anlamlı bir inhibisyon gelişti. (p<0.05, Wilcoxon Rank Test).

Günümüzde uterin kontraksiyonları inhibe etmek için beta mimetikler (ritodrin, terbutalin, izoksuprin, salbutamol), magnezyum sülfat, prostaglandin sentetaz inhibitörleri (indometazin), kalsiyum kanal blokörleri (nifedipin), nitrik oksit, oksitosin antagonisti (atosiban) ve potasyum kanal açıcılar kullanılmaktadır[10].

Literatür incelendiğinde nebivololün uterin kontraksiyonlar üzerine etkisi çalışılmamıştır. Ancak nebivololün damar düz kaslarına olan gevşetici etkisi çalışılmış olup etkisini NO ve cGMP bağlı mekanizmalarla göstermektedir[3,11,12]. Deney hayvanlarında yapılan çalışmalarda sıçan hipokampal membranlarına biraz bağlanma dışında, alfa₁ adrenerjik, Beta₂-adrenerjik, Dı-dopamin, D₂-dopamin, Hı-histamin, H₂-histamin, kolinerjik, muskarinik, μ-opiyad, benzodiyazepin ve Ca⁺² kanal siteleriyle anlamlı bir bağlanma görülmemiştir. Nebivoloün terapotik dozlarda intrinsik sempatomimetik aktivitesi (İSA) ve uygun bir membran dengeleyici etkisi de yoktur[13,14].

Yapılan çeşitli çalışmalarda nebivololün hipertansif hastalarda plazma ve üriner nitrat düzeylerini anlamlı olarak arttırdığı tesbit edilmiştir. Bu arttırma işlemi hem NO'in oksidatif yıkıma karşı korunması hem de sentezinin uyarılması yoluyla olur. Bu konuyla uyumlu olarak nebivololün sağlıklı gönüllülerde sistemik oksidatif stresi, azalttığı da yapılan bir çalışmada ortaya konmuştur[15].

NO biyoaktivitesini arttırmasına ek olarak nebivoloün antioksidan özelliği olduğu da ileri sürülmektedir. Burada dikkat çeken bir konu da izoprostanlardır. Bu maddeler oksidatif stres varlığında miktarları artan, araşidonik asidin serbest radikallerce katalizlendiği peroksidayonla oluşan, prostaglandin benzeri bileşiklerdir[16]. Yapılan bir çalışmada nebivololün standart dozda oral kullanımı, vücuttaki en önemli izoprostan olan 8-iso-PGF_2α nın idrarla atılımını belirgin olarak azaltmıştır. Bu nebivoloün antioksidan etkileri olduğunu gösteren bir bulgudur[17].

Tüm bu çalışmalar nebivololün etkilerini NO üzerinden gösterdiğini destekler niteliktedir. Literatürde NO'in kontraksiyon inhibisyonu yapan etkisi çeşitli çalışmalarda ortaya konulmuş ve bu çalışmalarda NO aracılı etki eden ajanların uterin kontraksiyonları inhibe edici etkileri gösterilmiştir[18,19].

Bu açıdan bakıldığında çalışmamızın uterin kontraksiyon inhibisyonu konusuna yeni bir bakış açısı kazandırmasını umuyoruz.

References

1. Cleophas TJ. Experimental evidences of selective antagonistic action of nebivolol on-1-adrenergic receptors. J Clin Med 1998; 2: 2-25.
2. Van Bortel LM, de Hoon JN, et al. Pharmacological properties of nebivolol in man. Eur J Clin Pharmacol 1997; 51: 379-384.
3. Ignarro LJ, Byrns RE, Trinh K, Sisodia M, Buga GM. Nebivolol: a selective beta (1)-adrenergic receptor antagonist that relaxes vascular smooth muscle by nitric oxide- and cyclic GMP-dependent mechanisms. Nitric Oxide 2002; 7: 75-82.
4. Cockcroft JR, Chowienczyk PJ, Brett SE, et al. Nebivolol vasodilates human forearm vasculature: evidence for an L-arginine/NO-dependent mechanism. J Pharmacol Exp Ther 1995; 274: 1067-1071.
5. Bowman AJ, Chen CP, Ford GA. Nitric oxide mediated venodilator effects of nebivolol. Br J Clin Pharmacol 1994; 38: 199-204.
6. Arosio E, De Marchi S, Prior M, Zannoni M, Lechi A. Effects of nebivolol and atenolol on small arteries and microcirculatory endothelium-dependent dilation in hypertensive patients undergoing isometric stress. J Hypertens 2002; 20: 1793-1797.
7. Ledingham MA, Thomson AJ, Greer IA, Norman JE. Nitric oxide in parturition. BJOG 2000; 107: 581-593.
8. Rang HP, Dale MM, Ritter JM. Pharmacology. 3rd Edition, New York: Churchill Livingstone, 1995: 203-213.
9. Sieben G, Van Neuten L, Symoens J. Nebivolol in hypertension. One-year treatment data. Drug Invest 1991; 3: 193-195.
10. Çiçek MN, Akyürek C. Çelik Ç. Haberal A. (editörler). Kadın Hastalıkları ve Doğum Bilgisi. Güneş Tıp Kitabevi 2006: 734.
11. Gupta S, Wright HM. Nebivolol: A highly selective beta-adrenergic receptor blocker that causes vasodilation by increasing nitric oxide. Cardiovasc Ther 2008; 26: 189-202.
12. Frazier EP, Michel-Reher MB, Sand C, et al. WITHDRAWN: Is nebivolol a beta(3)-adrenoceptor agonist? Eur J Pharmacol 2008; 10: 10-16.
13. Mangrella M, Rossi F, Fici F, Rossi F. Pharmacology of nebivolol. Pharmacol Res 1998; 38: 419-431.
14. Janssens WJ, Xhonneux R, Janssens PAJ. Animal pharmacology of nebivolol. Drug Invest 1991; 3: 13-24.
15. Napoli C, Liguori A, De Nigris F. Benefical effects of nebivolol on the NO-pathway in essential hypertensive patients. Eur Heart J 2002; 23: 210.
16. Roberts LJ, Morrow JD. The generation and actions of isoprostanes. Biochim Biophys Acta 1997; 1345: 121-135.
17. Troost R, Schwedhelm E, Rojczyk S, Tsikas D, Frolich JC. Nebivolol decreases systemic oxidative stress in healthy volunteers Br J Clin Pharmacol 2000; 50: 377-379.
18. Hekimoglu A, Celik F, Tas T, Ece A, Kavak V. The contribution of nitric oxide on the relaxation effects of diethylstilbestrol. Saudi Med J 2008; 29: 662-667.
19. Lees CC, Lojacono A, Thompson C, et al. Glyceryl trinitrate and ritodrine in tocolysis: an international multicenter randomized study. GTN Preterm Labour Investigation Group. Obstet Gynecol 1999; 94: 403-408.