Periodontitli Hastalarda Herpes Virüslerin Görülme Sıklığının PCR ile Belirlenmesi

Amaç: Yakın zamanlarda yapılan çalışmalarda herpesvirüslerle periodontit şiddeti arasındaki ilişki ortaya konmuştur. Mevcut çalışmada periodontitli hastalardan alınan subgingival krevikular sıvı örneklerinde farklı herpesvirüslerin varlığının araştırılması ve bu hastalardaki herpesvirüs sıklığı ile periodontitin seyrini belirlemede önemli olan, plak indeksi (Pİ), gingival indeks (Gİ) ve cep derinliği (CD) gibi parametreler arasında bir ilişki olup olmadığının belirlenmesi amaçlandı.

Gereç ve Yöntem: Bu amaçla, Elazığ Diş Hastanesi Periodontoloji Kliniğine başvuran periodontitli 52 hastadan ve periodontit yönünden sağlıklı 20 bireyden paper pointler periodontal ceplere yerleştirilerek krevikular sıvı örnekleri alındı. Daha sonra, bu örneklerden DNA izolasyonları gerçekleştirildi. Elde edilen DNA'larda ve dört herpesvirüse özgül primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile herpes virüs varlığı araştırıldı.

Bulgular: Polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarına göre, 52 periodontitli hasta örneğinin %61.5'inde EBV, %53.8'ünde CMV, %32.6'sında HSV-1 ve %25'inde HSV-2 pozitifliği tespit edildi.

Sonuç: Sonuç olarak, periodontitler ve bunların klinik seyirleri ile EBV ve CMV arasında kuvvetli, HSV'lar ile de zayıf bir etyolojik ilişkinin olduğu kanaatine varıldı.

Objective: Recently, a relation was revealed between herpesvirus and severity of periodontitis. The aim of this study was to determine prevalence of herpesvirus in crevicular fluid sample which were taken from patients with periodontitis and to reveal a relation between clinical paremeter (plak indeks; PI, gingival indeks; GI and probing depth; PD) and present of herpesvirus.

Materials and Methods: For this aim, total of 52 patients with periodontitis and 20 healthy persons who attend to periodontology clinic of Elazig Tooth Hospital were included the study. Crevicular fluid of sample of participants was taken with paper point. Later, DNAs of the samples was extracted. The presence of herpes viruses were investigated with Polymerase Chain Reaction (PCR) using four specific primers.

Results: EBV was determined in 61.5% of 52 patient's sample. CMV was determined in 53.8% of 52 samples. HSV-1 and HSV-2 were determined respectively in 32.6 % and 25 % of 52 samples.

Conclusion: As result, presence of a strong etiologic relation between presence of EBV, CMV and periodontitis, its clinic condition and a weak etiologic relation between HSV and periodontitis, its clinic condition were convinced.

Giriş

Periodontit, dişetlerinde başlayan iltihabi değişikliklerin derin periodontal dokulara yansıdığı bir diş hastalığıdır[1]. Kronik periodontit, periodontal hastalıkların en sık rastlanılan tipi olup 35-40 yaşından sonra popülasyonun büyük bir kısmını etkilemektedir. Kronik periodontit, primer etiyolojik ajan olarak mikrobiyal plağın ve plak birikimini kolaylaştırıcı lokal faktörlerin sorumlu tutulduğu inatçı ve ilerleyici bir periodontit formudur. Kronik periodontitlerde yüksek oranda (%90) anaerob ve gram negatif bakteriler izole edilmektedir[2,3]. Yakın zamanlarda yapılan çalışmalarda herpes virüslerle periodontit şiddeti arasındaki ilişki ortaya konmuştur. Bu çalışmalar hastalığın etyopatogenezinin daha ayrıntılı olarak anlaşılması yönündeki çalışmalara katkı sağlamıştır. Ancak, bugün için periodontit etyopatogenezinde herpesvirüslerin rolü ile ilgili tartışmalar devam etmektedir[4]. Mevcut çalışmada, periodontitli hastalardan alınan subgingival krevikular sıvı örneklerinde, farklı herpes virüslerin (Herpes simpleks virüs tip 1 ve 2; HSV-1 ve HSV-2, Epstein–Barr virüs; EBV ve insan sitomegalovirüs; HCMV) varlığının araştırılması ve bu grup hastalardaki herpesvirüs sıklığı ile, periodontitin seyrini belirlemede önemli olan, plak indeks'i (Pİ), gingival indeks (Gİ) ve cep derinliği (CD) gibi parametreler arasında bir ilişki olup olmadığının belirlenmesi amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Çalışma Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı ile Elazığ Diş Hastanesi'nin ortak katkıları ile gerçekleştirildi. Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu'nca onaylanan çalışmada Elazığ Diş Hastanesi Periodontoloji Kliniği'ne başvuran periodontitli 52 hastadan alınan krevikular sıvı örnekleri hasta grubunu oluştururken kontrol grubu olarak 20 sağlıklı bireyden krevikular sıvı örnekleri alındı. Hasta grubunu yaşları 33-67 arasında değişen (ortalama 49.9) 23 bayan ve 29 erkekten toplanan örnekler oluştururken, sağlıklı grubu da yaşları 30-56 arasında değişen (ortalama 43.3) 10 erkek ve 10 bayandan toplanan örnekler teşkil etti.

Örneklerin toplanması ve analize hazırlanması: Çalışmada kullanılan örnekler periodontoloji polikliniğinde hasta başında alındı. Örnekler son altı ay içinde antibiyotik almamış hastalardan temin edildi. Genellikle bu tip çalışmalarda sıkça kullanıldığı ve bu sayede çalışmalar arasında mukayese imkânı sağladığı için, örnek alınan hastaların Silness- Löe'ün plak indeksi ve gingival indeksi skorlandı (Tablo 1 ve 2). Ayrıca hastaların diş cep derinliği belirlendi.

Hastalardan örnekler alınmadan önce hastaların ağızlarını 30 sn kadar klorhexidine ile yıkamaları istendi. Paper pointler (micro-IDent-plus/Hain-Lifescience) diş hekimleri tarafından periodontal ceplere yerleştirildi. Krevikular sıvıyı emmesi için 30 sn bekletildikten sonra, paper pointler steril kapaklı ependorflara alındı. Örnekler buz aküleri ile birlikte hızlı bir şekilde laboratuvara ulaştırıldı. Örnekler laboratuvarda çalışılacak zamana kadar -80ºC derecede stoklandı.

Tüm diş örneklerinden QIAamp DNA Mini Kit ile üretici firmanın (Qiagen) önerileri doğrultusunda DNA izolasyonu yapıldı.

Aşağıda belirtilen primerler kullanılarak In-House PCR ile HSV-1, HSV-2, EBV, CMV-1, CMV-2 varlığı izole edilen DNA örneklerinde araştırıldı (Tablo 3).

Tüm PCR çoğaltma ürünleri etidyum bromidli %2'lik agaroz jelde yürütülerek elektroforezle yürütüldü ve UV transilluminatörde incelenerek oluşan bantlar değerlendirildi.

Hastalıklı gruptaki EBV, CMV varlığı ile sağlıklı gruptaki EBV, CMV varlığı arasındaki farkın anlamlı olup olmadığını tespit etmek için fisher's exact testi uygulandı. Virüs varlığı ile Pİ, Gİ ve cep derinliği arasındaki ilişki spearman's korelasyon analizi ile gerçekleştirildi.

Bulgular

Yapılan PCR neticesinde 52 örneğin 32'sinde (%61.5) EBV pozitif olarak belirlendi. EBV DNA yönünden pozitif ve negatif olan bazı örneklerin PCR ürünlerinin jel görüntüsü Şekil 1'de verilmiştir.

Aynı örneklerden CMV DNA pozitifliğini belirlemek için yapılan nested PCR sonucunda ise örneklerin 28 inde (%53.8) CMV DNA pozitifliği tespit edildi.

Hasta grubunun HSV-1 ve HSV-2 primerleri ile kurulan PCR sonuçlarında ise HSV-1 ve HSV-2 pozitifliği sırayla 17 (%32.6) ve 13 (%25) olarak tespit edildi. Hasta ve sağlıklı grubun örneklerinde virüslerin görülme sıklığı tablo 4 de gösterildi (Tablo 4).

Elde edilen pozitif PCR sonuçlarının hastaların plak indeksi, gingival indeksi, cep derinliği ile yapılan spearman's rho korelasyon analizinde EBV-1 varlığı ile bahsedilen üç parametre arasında anlamlı bir korelasyon tespit edilirken (P< 0.01) CMV varlığı ile 2 parametre (plak indeksi (P<0.01), cep derinliği (P<0.05) arasında anlamlı bir korelasyon tespit edilmiş fakat gingival indeks ile anlamlı bir ilişki gösterilememiştir.

Elde edilen sonuçlara göre HSV-1 ve HSV-2 varlığı ile plak indeksi, gingival indeksi, cep derinliği arasında anlamlı bir korelasyon ilişkisi yoktur.

Tartışma

Gingivit ve periodontitin genellikle diş yüzeyinde kolonize olan bakteriler tarafından başlatılan hasarın sonucunda meydana geldiğine inanılmaktadır[5]. Bu görüşün temelinde, plak varlığı ile gingivititis ve periodontit arasındaki pozitif ilişki yatmaktadır. Plak mevcudiyetinde gingivitin ve periodontitin şiddeti artmaktadır[6]. Bakteriyel plağın periodontit patogenezindeki önemine ait kanıtların olmasına rağmen bozuk oral hijyen, sigara kullanımı gibi ekzojenik faktörler, insanlar arasındaki immün cevap farklılıkları gibi endojen faktörler hastalığın meydana gelmesine katkı yapmaktadır[7-10]. Yakın zamanda yapılan çalışmalarda bazı virüslerin periodontal hastalık gelişimi ve şiddetine katkılarının olabileceği ileri sürülmüş ve buna dair kanıtlar elde edilmiştir[5,11,12]. Herpesvirüs enfeksiyonlarına genellikle çocukluk çağında oral sekresyonlar ile temas yoluyla yakalanılmaktadır[13-16]. Primer herpetik gingivit viral orjinli gingivitin en sık sebebidir[17]. Bu virüslerin rekürrensleri herpes labialis'de olduğu gibi genellikle mukokutanöz birleşim yerlerinde olmaktadır. Damak ve gingiva rekürrenslerin diğer sık görüldüğü yerlerdir[18,19]. İnsanların %90' ından fazlasının EBV ile enfekte olduğu düşünülürken, CMV nin endüstrileşmiş ülkelerde 20 li yaşlara kadar populasyonun %90'ını etkilediği hesaplanmaktadır[20-25]. Herpes virüslerin periodontal hastalık etyolojisinde yer almaları ile ilgili hipotezler bu virüslerin periodontal hastalığı olan kişilerin gingival dokularında, gingival krevikular sıvılarında, subgingival plaklarında tespit edilmesine dayanmaktadır[5,26] Yaptığımız çalışmadaki EBV ve CMV pozitifliği oranları hem yurt dışı hem de yurt içinde yapılan çalışmalarla uyumlu bulunmuştur[11,12]. Yapılan çalışmaların pek çoğunda değişken oranlarda genel HSV veya HSV-1'in varlığı bildirilirken, HSV-2 varlığı ya düşük oranlarda belirlenmiş ya da tespit edilmemiştir[27-29].

Sonuç olarak, EBV ve CMV varlığı ile periodontit ve periodontit'in klinik şiddeti arasında kuvvetli bir ilişki olduğu kanaatine varılırken HSV ler ile periodontit arasındaki ilişkinin zayıf olduğu düşünülmektedir. Fakat konu ile ilgili yapılan çalışmaların az olması, çalışmalarda pek çok farklı parametreye bakılma zorunluluğu ve değişken sonuçların elde edilmesi dikkate alındığı zaman, eldeki bulgulara göre herpesvirüslerle periodontit arasında sebep-sonuç ilişkisinin tam olarak aydınlatılması için reseptör düzeyinde çalışmaların artırılması gerektiğini düşünmekteyiz.

References

1. Eisenberg L, Suchow R, Coles RS, Deasy MJ. The effects of metronidazole administration on clinical and microbiologic parameters of periodontal disease. Clin Prev Dent 1991; 13: 28- 34.
2. Klinge B, Attström R, Karring T, et al. 3 regimens of topical metronidazole compared with subgingival scaling on periodontal pathology in adults. J Clin Periodontol 1992; 19: 708-7l4.
3. İpek F, Gül K. Kronik periodontitisin klasik mekanik tedavisine ek olarak sistemik metronidazol uygulanımının klinik ve mikrobiyolojik etkilerinin incelenmesi. Dicle Tıp Derg 2007; 34: 203-210.
4. Contreras A, Slots J. Herpesviruses in human periodontal disease. J Periodontal Res 2000; 35: 3-16.
5. Cappuyns I, Gugerli P, Mombelli A. Viruses in periodontal disease – A review. Oral Diseases 2005; 11: 219–229.
6. Migliorati CA, Madrid C. The interface between oral and systemic health: The need for more collaboration. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 11-16.
7. Eisenmann AC, Eisenmann R, Sousa O, Slots J. Microbiological study of localized juvenile periodontitis in Panama. J Periodontol 1983; 54: 712–713.
8. McNabb H, Mombelli A, Gmür R, Mathey-Dinc¸ S, Lang NP. Periodontal pathogens in shallow pockets in immigrants from developing countries. Oral Microbiol Immunol 1992; 7: 267–272.
9. Bergström J. Cigarette smoking as a risk factor in chronic periodontal disease. Community Dent Oral Epidemiol 1989; 17: 245–247.
10. Kornman KS, Page RC, Tonetti MS. The host response to the microbial challenge in periodontitis: Assembling the players. Periodontol 2000; 14: 33–53.
11. Klemenc P, Skaleric U, Artnik B, Nograsek P, Marin J. Prevalence of some herpesviruses in gingival krevikular fluid. J Clinic Virol 2005: 34; 147–152.
12. Contreras A, Nowzari H, Slots J. Herpesviruses in periodontal pocket and gingival tissue specimens. Oral Microbiol Immunol 2000; 15: 15-18.
13. De Araujo T, Berman B, Weinstein A. Human herpesviruses 6 and 7. Dermatol Clin 2002; 20: 301–306.
14. Roizmann B, Desrosiers RC, Fleckenstein B, et al. The family Herpesviridae: An update. The Herpesvirus Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch Virol 1992; 123: 425–249.
15. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet 2001; 357: 1513-1518.
16. Buxbaum S, Geers M, Gross G, et al. Epidemiology of herpes simplex virus types 1 and 2 in Germany: what has changed? Med Microbiol Immunol 2003; 192: 177-181.
17. Nikkels AF, Pierard GE. Chronic herpes simplex virus type I glossitis in an immunocompromised man. Br J Dermatol 1999; 140: 343-346.
18. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet 2001; 357: 1513-1518.
19. Buxbaum S, Geers M, Gross G, et al. Epidemiology of herpes simplex virus types 1 and 2 in Germany: What has changed? Med Microbiol Immunol 2003; 192: 177-181.
20. Cohen JI. Epstein–Barr virus and the immune system. Hide and Seek. JAMA 1997; 278: 510-513.
21. Yao QY, Rickinson AB, Epstein MA. Oropharyngeal shedding of infectious Epstein–Barr virus in healthy virusimmune donors. A prospective study. Chin Med J 1985; 98: 191–196.
22. Rivera-Hidalgo F, Stanford TW. Oral mucosal lesions caused by infective microorganisms. I. Viruses and bacteria. Periodontol 2000; 21: 106-124.
23. Pass RF. Epidemiology and transmission of cytomegalovirus. J Infect Dis 1985; 152: 243-248.
24. Numazaki KA, Chiba S. Latent infection and reactivation of human cytomegalovirus. Serodiagn Immunother Infect Disease 1995; 7: 70–74.
25. Landolfo S, Gariglio M, Gribaudo G, Lembo D. The human cytomegalovirus. Pharmacol Ther 2003; 98: 269-297.
26. Scully C, Porter S. Orofacial disease: update for the dental clinical team: 2. Ulcers, erosions and other causes of sore mouth. Part I. Dent Update 1998; 25: 478-484.
27. Santangelo R, D'Ercole S, Graffeo R, et al. Bacterial and viral DNA in periodontal disease: A study using multiplex PCR. New Microbiol 2004; 27: 133-137.
28. Saygun I, Kubar A, Özdemir A, Yapar M, Slots J. Herpesviral-bacterial interrelationships in aggressive periodontitis. J Periodont Res 2004; 39: 207-212.
29. Ling LJ, Ho CC, Wu CY, Chen YT, Hung SL. Association between human herpesviruses and the severity of periodontitis. J Periodontol 2004; 75: 1479-1485.